简述全内反射荧光显微术的原理和应用

简述全内反射荧光显微术的原理和应用

摘要：全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反射产生的消逝波激发样品,使样品表面数百纳米厚的薄层内

的荧光团受到激发，再用高灵敏度和高时间分辨率的摄像机CCD来捕捉

荧光并用计算机进行显像，从而实现对生物样品观测的一种新生技术。

由于消逝波特点及CCD的优势使全内反射荧光显微镜具有高信噪比和高

时间分辨率，因此它在对单分子的动态观测具有很高的应用价值。本文

将对全内反射荧光显微镜的原理及应用和发展展望作一个简要的介绍。

关键词：全内反射消逝波衍射极限单分子的动态观测

0 引言：人类自诞生以来不但在不断的改进自己的生产工具，同时也在不断的改

进自己观察世界和了解这个世界的工具，其间显微镜的制造应改说为人类

观察微观世界打开了一扇窗户，它可以称得上是人类观察认识世界上的一

次革命。此后各种新的观察工具相继问世，使人类对微观世界的认识达到

了空前的高度。但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响,

存在分辨极限,瑞利将之归纳为R ≥0. 61λ/nsinθ,其中λ为成像光波波

长, nsinθ为物透镜的数值孔径,即NA 值，因此光学显微镜空间分辨极限～

250 nm。于是人们研制了拥有点分辨率: 0.2nm的电子显微镜。进入80年代，

非光学类扫描探针显微术特别是原子力显微镜的出现更是将成像的分辨

率推进到纳米的精度。但这些显微技术在不同程度上存在系统结构复杂、

成像检测环境要求苛刻等困难，尤其是不能象光学显微术那样提供重要的

光学信息（如偏振态、折射率、光谱等）和进行无损伤性生物活体探测，

这些因素均严格限制了它们在高分辨率细胞成像中的应用。近年来人们开

发出了一系列光学显微镜如：目前国际上公认的最有前途的单分子光学成

像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术[1 ,2 ]

和全内反射荧光显微术.其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对

单分子活体探测的可行性，使得这些技术在分子生物学、分子化学、激光

医学及纳米材料等领域有着广泛应用，并将对未来的光测技术的发展和科

学的进步产生深远的影响。其中，全内反射荧光显微术是近年来新兴的一

种光学成像技术，它利用全内反射产生的隐失场来照明样品，从而致使在

百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这

种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合，目前已

成功的实现100nm甚至更低的空间分辨率。

1：全内反射荧光显微术的基本原理

1.1 全内反射

全内反射是一种普遍存在的光学现象。一束平面光波从折射率为n1的介质 进入到折射率为n2的介质中。入射光在界面上一部分发生反射，另一部分则

发生透射见图1。入射角i和透射角r之间满足关系式

n1sini=n2sinr (1)

图1：光在不同介质传播的光路图

若n1大于n2，例如折射率为n1的是玻璃，折射率为n2的是液体溶液。当入射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90°，当入射角大于或者等于临界角时，光不再透射进溶液，而是发生全反射，。由Snell定律可知 =90° θc=sin-1(n2/n1) (2) θ

2

由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如图2所示

图2：全内反射及消逝波的产生

1.2：消逝波的产生及其特点

从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，叫做消逝波，也称隐失波或倏逝波。它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减[3 ]。可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度ｚ减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为消逝场(evanescent field)。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长[4]。消逝波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光消逝波。消逝波是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，在平行界面方向以平行波场方式传播而在垂直界面方向则是呈指数衰减。对于可见光波长而言，浸透深度为～100nm[5]。图2 所示那界面上薄薄的一层为消逝波

1.

1.3：CCD相机的作用

生物样品的荧光物质全被内反射产生的消逝波照射之后，发出荧光，有一种特制的电荷耦合器件CCD相机进行捕捉的。CCD相机分为两种：制冷型和快速型制冷型CCD 非常灵敏,可以实现荧光弱信号的探测;而快速CCD 则拥有

成像速度很快的优点(当然现阶段很少有CCD 相机能兼有以上两个优点) ,目前使用CCD 探测,可达到的量子产率已到～80 % ,成像速率～200 Hz (帧/ 秒) 。当对活细胞成像时,为了达到单分子级的灵敏度或是为了减少曝光时间,需要采用图像增强器。CCD相机的高灵敏度特点使全内反射荧光显微镜利用消逝波照射样品并使其成像成为可能，也成就了其高信噪比。而快速成像特点提高了其时间分辨率，使得观察单分子的运动、细胞物质的分泌、蛋白质的相互作用成为可能并成其为这方面的优势观察仪器。

2，全内反射显微镜的分型及其结构

全内反射荧光显微镜根据其目镜的不同可分为目镜型和棱镜型

2.1 棱镜型全内反射荧光显微镜

棱镜型全内反射荧光显微镜就是利用激光经过棱镜并产生全内反射，其消逝波照射已被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入目镜并被CCD相机捕捉，其光路图如图3所示：其简易光路图如图4所示：

图3 棱镜型全内反射荧光显微镜光路示意图

图4 棱镜型的简易光路图