细胞培养污染的检验与去除
浅谈细胞培养中微生物污染与防控措施
生长 可证 明该 细胞受 到 了细菌 的污 染 。 １２ 支原 体 污 染 ． 支 原 体 污 染 不 能 用 肉眼 或 光 学显 微镜 检查 细胞观 察 出来 ， 带有 一 定的 隐蔽 性 ， 易被 人们忽 视 。 当细胞 被支 原体 污染 后 ， 细胞营 养 液可 能毫无 变 化 ，短 期 内细胞 没 有 明显 的病理 变
性 作用 ，因此 特 别要注 意不 同的细胞 培养 的特 点
培养 基上培 养 ， 如果见 到培养 基上 有霉 菌 生长 ， 也 可 以判 断该 细胞 受到霉 菌污 染 。霉 菌 污染 可 以使
细胞变 形 、 脱落 。霉菌孢 子对 环境 的耐 受 力很强 ，
和 对抗 生素 耐受程 度 的不 同。在对 具 体 的细胞选
种 营养 成分 隐性污 染细菌 没有 被检 测 出来所 造 成 的。 即使在 细胞培 养液 中加 入 了抗菌 素 ， 得细 菌 使
繁殖 处于 抑制状 态 ， 细胞 生长 不受 明显 影 响， 易 不
即淘汰 该细 胞和 培养 液 。 外 ， 此 支原 体污 染还可 用
荧光 染色法 ［ 和相 差显 微镜 观察 法 ［ 检测方 法 。 ｓ 等 １３ 霉菌 污染 ． 霉 菌污 染和 细 菌污 染 比较 相似 ， 都 可 以 由无 菌操 作环 境差 或者 器材 等 消毒 不彻底 造 成 。霉菌 污染 经 常发 生在潮 湿 的季节 或 者潮湿 的操 作环境 。可 以通 过 肉眼观 察细 胞 生长和 培养 基 培养 的方 法来检 测 霉菌 污染 。霉 菌短 期 内不会 引起 营 养液 的浑浊 ，但 是在 细胞 瓶壁 可 以见 到 明
广 东畜牧兽 医科技
２１ 年 （ 鲞 塑 ００ 第 箜
一
经验交流 ・９ ４・
细胞培养中的污染问题与对策
细胞培养中的污染问题与对策细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究细胞的生长、分化和功能。
然而，在进行细胞培养的过程中，污染是一个不可忽视的问题。
污染源可以来自外部环境、工作环境或实验操作不当。
对于细胞培养的研究结果的准确性和有效性而言，解决污染问题的对策至关重要。
首先，污染问题可能来自实验室环境以及操作者自身。
实验室环境中存在的微生物污染可能会导致细胞培养的受损。
因此，保持实验室环境的清洁是非常重要的。
定期进行实验室卫生和表面消毒是降低微生物污染的有效措施。
此外，操作者在进行细胞培养时需要严格遵守无菌操作规程，以减少自身的污染对细胞的影响。
操作者需要穿戴合适的实验室清洁工作服、手套和口罩，并在操作过程中注意避免直接接触细胞培养物。
其次，细胞培养中使用的培养基和试剂也是潜在的污染源。
为了避免污染，选择高纯度的培养基和试剂是至关重要的。
购买来自可靠供应商的培养基和试剂，严格遵循使用说明书的指导，可以减少产品本身的污染。
此外，在实验进行过程中，避免将培养基和试剂暴露在不洁的环境中，并妥善保存这些试剂，以防止其受到污染。
另外，细胞培养过程中的传代也是容易导致污染的环节。
细胞传代是保持细胞生长的关键步骤，但传代时的细胞污染可能会导致细胞功能和表型的变化。
为了避免细胞污染，应该定期对细胞进行鉴定和检测，特别是使用发展中的分子标识技术。
这些技术可以帮助确定细胞是否保持纯种，以及是否受到污染。
此外，定期保存冻存品库并且用来传代的细胞不要超过特定的传代次数，以保持细胞的良好生长状态。
另一个需要关注的污染问题是培养器具的污染。
培养器具包括培养皿、培养瓶、移液器等。
这些器具在使用之前需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌状态。
在使用过程中，需要注意避免直接接触器具内外部分，以减少污染的可能性。
同时，定期更换使用的培养器具也是非常重要的，以防止积累污染物。
最后，除了以上提到的对策，培养载体选择也可以在一定程度上减少细胞培养时的污染问题。
细胞培养中细菌类微生物污染的快速检测
细胞培养中细菌类微生物污染的快速检测摘要】目的：观察PCR快速检测用于细菌类微生物污染的细胞培养液的应用价值。
方法：选择人为污染的HeLa细胞作为研究材料，选择16s rRNA基因序列作为细菌类微生物通用引物，选择煮沸法提取细菌基因组DNA，设计PCR检测培养细胞污染的程序，分析检测结果。
结果：人为污染白色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的Hela细胞，其培养上清液中可扩增出与目的片段相符的片段。
结论：煮沸法降低了细胞培养中细菌类微生物污染检测的难度，能够早期发现污染，为珍贵细胞的挽救争取时间，具有低成本，高效率的优势，具有较高推广应用价值。
【关键词】PCR 细菌培养细胞【中图分类号】R446.5 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2014）16-0315-01本次研究以人为污染的HeLa细胞作为研究材料，观察了煮沸法提取细菌基因组DNA并设计PCR检测培养细胞污染的程序用于细菌类微生物污染细胞培养液检测的实际灵敏度及可行性，旨在设计一种成本低，效率高的检测方法，为今后的工作提供指导依据，现将成果报道如下。
1. 资料与方法1.1 细胞株细菌参考株选择白色葡萄球菌、大肠杆菌及绿脓杆菌；对照细胞株选择正常HeLa细胞。
1.2 培养及检测方法培养及检测方法如下：1）分别刮取以上细菌冰晶，接种于LB培养基， 37℃过夜培养，各取50μl上述培养物接种于新传代的HeLa细胞；2）取各组培养上清液，离心、弃上清后加入200μl PBS制成重悬液，沸水煮5min，重复离心，吸出上清液加入冰预冷的异丙醇200μl，-20℃静置15min，重复离心，弃上清，用50μl TE缓冲液重悬；3）PCR扩增采用细菌类16S rRNA特异性序列通用引物。
上游引物（A-17）:5′-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;下游引物（3-17）:5′-AAG GAG GTA ATC CAG CC-3′;扩增片段约1500bp。
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
细胞培养中常见的污染的处理
细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
Sigma公司的使用时用50ug/ml Tylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。
细胞培养中的微生物污染预防与处理
细胞培养中的微生物污染预防与处理细胞培养作为一种重要的实验手段，在生物医学研究领域中得到广泛应用。
然而，在细胞培养的过程中，微生物污染往往成为一个严重的问题，可能对实验结果产生不良影响甚至导致实验结果的无效化。
因此，预防和处理细胞培养中的微生物污染是细胞培养实验中不可或缺的一环。
首先，预防细胞培养中的微生物污染至关重要。
以下是一些有效的预防措施：1. 严格执行无菌操作：细胞培养实验中，无菌操作是最基本也是最重要的环节。
在进行培养操作前，实验人员应该经过相关的培训和指导，了解无菌操作的正确步骤和技巧。
例如，在实验操作前经常更换手套、使用经过有效消毒的培养器具和培养基等。
2. 经常清洁和消毒实验环境：实验室环境和设备的清洁和消毒是预防微生物污染的另一个重要方面。
实验室的工作台面、实验室衣物、培养箱、孵化器等都需要经常进行清洁和消毒，以减少微生物的存在和传播。
3. 控制空气中的微生物：空气中的微生物往往是细胞培养中的污染源之一。
为了降低空气污染带来的风险，实验室应该配备高效过滤器的实验室通风设备，定期更换过滤器。
此外，实验室应该设置限制进出实验室的措施，例如，安装空气帘或者设置冲洗区域。
4. 识别和处理污染源：在细胞培养中排查和识别潜在的污染源是很重要的。
实验人员应经常检查培养器具、培养基和试剂等是否存在污染，一旦发现污染，应及时处理。
处理污染源的方法包括更换受污染的培养器具、重新配制新的培养基或试剂等。
其次，当细胞培养中发生微生物污染时，采取适当的处理方法也是至关重要的。
1. 立即停止受污染的实验：一旦发现细胞培养被污染，实验人员应立即停止受污染的实验，并将受污染的培养器具和培养基等隔离处理，以防止污染的进一步传播。
2. 进行污染源检查：在处理微生物污染的同时，必须找出污染源，并加以处理。
通过对培养器具、培养基和试剂等进行检查，可以找到导致污染的原因，进而采取相应的措施。
3. 清洁和消毒工作环境：在处理污染源的同时，必须对实验室的工作环境进行清洁和消毒。
如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染
如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染在进行细胞培养实验的过程中，细菌与真菌污染是一个常见但也十分令人头疼的问题。
当我们在观察和分析细胞时，准确判断细胞培养中的细菌与真菌污染是至关重要的。
本文将从不同的角度探讨如何正确判断细胞培养中的细菌与真菌污染。
一、观察细胞形态观察细胞形态是判断细胞培养中是否存在细菌与真菌污染的一种重要方式。
细菌和真菌的形态和生长方式有很大的差异。
细菌在培养皿中呈现为小圆点状或线状的结构，而真菌则可能形成大而明显的菌落或菌丝。
此外，真菌会产生孢子，看起来像是一串串小颗粒。
通过观察细胞周围的结构，可以初步判断是否存在细菌与真菌污染。
二、检测培养基上的生长情况细胞培养中的细菌与真菌污染通常会导致培养基上的生长情况发生变化。
如果培养基上有细菌或真菌的存在，通常可以观察到菌落的形成。
在培养过程中，我们可以观察细胞生长的速度、密度和均匀性等指标，如果存在污染，这些指标可能会出现异常情况。
在评估培养基上的生长情况时，需要结合细胞培养的实际要求进行综合判断。
三、使用染色试剂染色试剂在细胞培养中的细菌与真菌污染判别中发挥着至关重要的作用。
常用的染色试剂有格拉姆染色和甲苯胺蓝染色等。
通过染色试剂的使用，细菌和真菌会呈现不同的颜色和形态。
细菌会呈现出紫色或蓝色，而真菌则通常呈现为绿色或红色。
通过对样品进行染色和观察，可以明确判断是否存在细菌与真菌污染。
四、利用PCR技术PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的基因检测技术，可以用于检测和鉴定细菌和真菌。
通过PCR技术，可以对细胞培养样品中的DNA进行扩增和分析，从而确定是否存在细菌与真菌污染。
PCR技术可以选择合适的引物，针对不同的细菌和真菌进行特异性扩增，提高判断污染的准确性。
五、更加严格的无菌操作在细胞培养实验中，更加严格的无菌操作是避免细菌与真菌污染的关键。
在实验过程中，我们应该始终保持实验室台面、培养皿、试管等工作区域的清洁。
在进行细胞培养前，用酒精或其他消毒液对操作台面进行清洁和消毒，避免细菌的传播。
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法
细胞培养中常见的污染情况、可能原因、解决方法细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
氟康唑去除细胞培养中的真菌污染
第２ ４卷
第 ４期
河 北 职 工 医 学 院 学 报
Ｊｕ ｎ ｌ ｆＨｅ ｅ ｄｃ ｌＣ ｌ ｇ ｏ ｏ ｔ ｕｎ ｕ ａｉｎ ｏ ｒａ ｂ ｉ ｏ Ｍｅ ｉａ ｏｌ ｅｆｒＣ ｎｉ ｉｇＥｄ ｃ ｔ ｅ ｎ ｏ
Ｖｏ ． ４．Ｎｏ． １２ ４
细胞培养 中的污 染分 为 两类 ， 学 污 染 和 生物 污染 。 化
生物 污染 中较 为常见 的是真菌 污染 ， 常见 的真 菌有 烟 曲 最 霉、 黑曲菌 、 孔子霉 、 毛霉菌 、 白色念珠菌 和酵 母菌 。真菌 是一种真核细胞 型微生 物 ， 单细胞 真菌称为酵母 菌 ； 细胞 多 真 菌 能 长 出菌 丝 和孢 子 且 交 结 成 团 ， 丝 状 菌 ， 称 霉 称 又 菌 Ｊ 。在进行细胞体外 培养时 ， 然做 了大量 的消 毒 和灭 虽 菌工作 ， 有时细胞污染现象仍不 可能完全避免 ， 但 尤其 在霉 雨季节进行细胞培养 更易污染 。笔者在试验过程 中经历 真 菌污染 ， 并对受 污染的细胞培养液基进 行初步鉴定 ， 应用 氟
良好 ， 用 于试 验 ， 正 常未 受 污 染 的细 胞 无 明显 差 异 。 可 与
３ 讨 论
细胞 培养 过程 中被 真菌污 染是 组织 培养 工作 的大 敌 ， 故从 一开始就要 十分重视 ， 积极采取措施 ， 应 防止 污染 。一
图 １ 人 宫 颈 痛 Ｈ ｌ 细 胞 真 菌 污 染 形 态 观 察 ｅａ
菌生长 ， 真菌的形态有 丝状 、 单细 胞 和长链 状排 列 的细胞 ， 到 ９ ｈ时 肉眼才观察到棉 絮状 的菌丝 团等 Ｊ ６ 。
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１
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维普资讯
康唑处理受污 染 的细 胞 ， 污染 得 到控 制 ， 代 后 已用 于 试 传
细胞污染的检测与去除
第二章 动物细胞培养第四节 细胞污染的检测与去除细胞培养最怕的就是细胞污染。
一旦细胞发生污染，轻的，导致实验无法正常进行，严重的，可能会导致细胞株的丢失。
细胞污染：是指细胞培养物中混入培养环境中的对细胞生存有害的成分或造成细胞不纯的异物。
细胞污染的主要途径有：1）空气因素：空气是微生物传播的最主要途径。
在超净工作台、细胞培养室工作时，不戴口罩，不带头套，面对操作间大声讲话、咳嗽等均可能造成细胞污染。
2）器材因素：主要是细胞培养用器材清洗消毒不彻底，致使污染物残留；培养箱没有定期消毒，易使细菌、霉菌孽生，形成污染。
3）操作因素：实验操作者无菌观念不强、操作不规范、甚至使用污染的器具等。
培养两种以上细胞时，交叉使用吸管或培养液瓶等导致细胞交叉污染。
4）血清或培养基：有些血清生产时已被支原体或病毒等污染，有的在培养基配制过程中已经污染，或者在培养基的存放过程中导致了污染。
5）组织样本：尤其在进行原代培养时，组织样本可能带菌，导致污染。
细胞污染的主要类型有（图1）：图1 细胞污染的主要类型第一，细菌污染：细菌是细胞培养中最常见的污染。
细菌种类繁多，形态多样，可呈球状、杆状和螺旋状。
因为细菌的繁殖速度快，被污染后，往往一天内即可通过肉眼观察发现，pH值也会突然降低，培养基的颜色也会很快变化，培养液会变浑浊。
轻微细菌污染的去除: 可使用5-10倍常用抗生素剂量的冲击法，加抗生素作用24-28 h，再换成常规培养液，有时可排除污染，但大部分细胞培养的细菌污染发现时就已经很严重了，无法挽救，最好直接丢弃，防止污染的扩大。
细胞培养细菌污染的主要检测方法有：肉眼观察法；培养检查法；显微镜观察法；PCR检测法等。
1）肉眼观察法：（图2），如图，这是正常生长细胞在不同时间的培养基的颜色，污染细胞培养基会变得浑浊，培养基会快速变黄（因大量细菌繁殖会导致pH 快速下降）。
刚传代细细胞培养中需要传代的细图2 正常生长细胞培养基的颜2）培养检查法：就是用细胞培养上清在无菌琼脂糖培养基平板上划线培养，37℃培养箱中培养过夜，看是否有细菌菌落长出（图3）。
细胞培养时遇到支原体污染怎么办
细胞培养时遇到支原体污染怎么办前言：细胞培养物被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效果显著，支原体污染的问题得以限制。
目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。
目前已知的主要污染源是动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶，例如，猪鼻支原体通过胰酶，在消化细胞时进入细胞培养物，并造成污染。
在原代细胞与传代细胞的检测中，原代细胞与传代细胞分离出支原体的频率是有明显差异的，传代次数越多的细胞，污染支原体的可能性就越大，这也是多次与动物血清、胰酶和已污染培养物的气溶胶接触后造成的，在原代细胞中，污染率低于4%，而传代细胞的污染率则高达57%~92%。
支原体的介绍支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。
革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。
支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。
大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。
对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。
细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。
细胞受支原体污染严重（1）据统计世界范围内大约有15%-35%的细胞培养物遭受了支原体污染。
（2）从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。
（3）欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。
细胞培养技术中常见的细胞污染问题及处理方法
细胞培养技术中常见的细胞污染问题及处理方法细胞培养是生物学研究中经常使用的一种重要技术手段。
然而，随着研究的深入，细胞培养中常常会遇到细胞污染的问题，这给实验结果的可靠性和准确性带来了很大的影响。
细胞污染主要包括细菌、真菌、酵母、病毒以及其他的微生物污染。
在细胞培养中，如何及时发现和处理细胞污染问题，是每个实验室都需要面对的重要课题。
细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
造成细菌污染的原因有很多，比如培养器具不洁净、操作不规范等。
当出现细菌污染时，可以通过观察培养物的外观变化来初步判断是否受到污染，比如培养物颜色的改变、气泡的形成等。
如果存在细菌污染的症状，可以通过将培养物进行细菌培养或细菌PCR检测以确认。
一旦确认细菌污染，需要立即更换培养器具，重做培养基，并对培养箱等设备进行彻底清洁和消毒。
真菌和酵母的污染在细胞培养中也是相对较常见的问题。
真菌和酵母污染一般表现为培养物的颜色变化、膜片上出现菌丝等。
当怀疑存在真菌和酵母的污染时，可以将培养物进行不同培养基上的转接和形态学观察，也可以通过真菌和酵母的特异性培养基进行检测确认。
处理真菌和酵母污染的方法包括体外灭菌、常规抗生素处理、加入抗真菌和酵母的药物等。
另外，病毒是一种较为严重的细胞污染问题。
病毒感染可以导致细胞凋亡、细胞功能紊乱甚至细胞死亡。
常见的病毒污染有常见冷感冒病毒、乙肝病毒等。
病毒污染的判断往往需要通过病毒培养、PCR或ELISA等技术进行鉴定。
处理病毒污染可以采用病毒灭活剂或直接更换细胞系等方法。
除了微生物污染外，还存在一些其他的细胞污染问题。
比如，细胞交叉污染是指来自其他细胞系的细胞误将自己的培养物中。
为了避免细胞交叉污染，可以采用细胞系的DNA指纹鉴定技术，或者使用经过认证的培养物，同时加强无菌操作的培养。
总结起来，细胞培养中的细胞污染问题多种多样，但我们可以通过细心观察培养物的变化、培养基的转接和不同培养基的形态学观察、特异性培养基的检测以及分子生物学方法的应用等，及时发现和处理细胞污染问题，确保实验的可靠性和准确性。
养细胞中有小黑点,是碎片or污染,如何防范处理
养细胞中有小黑点，是碎片or污染，如何防范处理养细胞中有小黑点，是碎片or污染？如何防范处理相信很多养细胞的新手都遇到过，在养细胞中，细胞在显微镜下观察小黑点，背景比较脏。
遇到这样的问题又不知道怎么去辨别细胞情况！！！如果在显微镜下观察到了小黑点，基本上可以将范围缩小到是细菌污染还是细胞碎片。
到底是污染还是碎片，可从以下几个方面进行判断：1、运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。
从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。
2、培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。
细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。
一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。
培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。
通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。
被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。
3、接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。
碎片？细菌？一目了然。
对于养细胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步骤最容易发生污染？最容易导致细菌污染的一个步骤就是细胞在水浴锅解冻后没有彻底消毒。
如果这个步骤发生污染的话，细胞接种24小时之内就会明显观察到细胞污染。
另外几个可能导致污染的操作是：放培养基的瓶子或者管子在用水浴锅预热后，没有彻底消毒。
实验员在操作过程中枪头有可能接触到被污染的部分而导致细胞污染。
为了防止这种情况，容器外表面包括帽子应喷洒75%乙醇彻底消毒，然后用无菌棉垫擦干。
实验员在操作过程中，移液器的枪尖可能会碰到超菌台内壁或者超菌台内放置的其他瓶子或设备，有时可能会碰到包含细胞的细胞培养瓶外表面，甚至会碰到手套，或者实验操作服的袖口。
以上所提到的任何一项操作失误，都会导致细菌污染。
保持无菌工作区是防止细胞污染的最佳方式：1、使用前和使用后，用75%乙醇对所有工作表面进行消毒。
如果操作过程发生液体溢出的情况，这一项特别重要；2、保持一个整洁的工作空间；工作区应该只包含必须的实验设备；3、在实验之前确保已经准备好所有需要的试剂和耗材，避免反复进出操作区；4、保证整个实验操作在经过彻底消毒的超菌工作台或者生物安全柜中进行。
细胞培养中“黑胶虫”污染的检测及防治
6、建立有效的监控机制：对细胞培养过程进行实时监控，特别是在培养液 更换、细胞传代等关键环节上要格外留意。通过定期检查和记录细胞生长情况、 生化指标等数据，及时发现并处理潜在的黑胶虫污染问题。
7、采用新技术手段：随着科技的发展，一些新的技术手段如基因测序、生 物信息学分析等也可用于检测和防治黑胶虫污染。通过这些技术手段的应用，可 以更早地发现污染源、追踪污染途径并制定有效的防控措施。
4、建立应急预案：实验室应建立针对黑胶虫污染的应急预案，以便在发生 污染时能够迅速采取有效的措施进行处理，最大程度地减少损失。
5、加强学术交流与培训：通过参加学术会议、研讨会等活动，了解和学习 最新的研究成果和方法，提高对黑胶虫污染的认识和应对能力。同时，对实验室 工作人员进行定期的培训和教育，提高他们的专业素养和操作技能。
5、使用适当的消毒剂：在细胞培养过程中，可以使用适当的消毒剂对实验 器材和环境进行消毒处理。常用的消毒剂有75%酒精、紫外线、甲醛等。在使用 消毒剂时，要严格按照使用说明进行操作，避免对细胞造成不良影响。
参考内容三
引言
随着人类文明的不断发展，塑料制品的使用日益普遍，由此引发的白色污染 问题也越来越严重。本次演示将探讨白色污染的污染现状及防治对策，旨在引起 人们对白色污染问题的，共同呵护环境。
参考内容
一、常用的细胞培养方法
细胞培养是一种广泛应用于生物学、医学和生物技术领域的技术。细胞培养 是指将活细胞种植在适宜的基质中，通过提供适宜的营养和环境条件，使细胞在 体外繁殖和生长。常用的细胞培养方法包括悬浮培养和贴壁培养。
1、悬浮培养：悬浮培养是将细胞悬浮在培养液中，通过搅拌或振荡使细胞 均匀分布，并保持悬浮状态。这种方法适用于大多数类型的细胞，包括一些难以 贴壁的细胞。
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第七节细胞培养污染的检验与去除一、细菌与霉菌的污染由于环境条件差和操作不当等原因，常可发生细菌和霉菌的污染。
常见污染的细菌有革兰阴性菌如：大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有葡萄球菌等，真菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子苗等。
霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有意物质杀死细胞。
镜下可见脑浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。
霉菌污染容易发现，大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。
细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。
抗生素及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。
工作中要特别注意和防止所用培养液和血清的污染，日前应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防止在培养细胞时造成污染。
二、支原体污染的检测与去除（一）支原体的检测1． PCR法原理该法是通过PCR技术将支原体16srRNA基因特异性扩增，来检测培养细胞中污染的支原体。
PCR引物选自16sr RNA基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。
扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。
16sr DNA引物用水稀释至40umol/L。
（1）.正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’（2）.反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’质粒pBR322引物用水稀释至40umol/L.（1）.正向引物：5’-CATCTCGGGCAGCGTTGGGT-3’（2）.反向引物：5’-AGCGCAAGCGGAGTCAGTGAGC-3’裂解缓冲液：10mmol/L Tris-HCL(pH8.3), 50mmol/L KCL, 2.5mmol/L Mgcl2, 5g/L Tween20和5g/L TritonX-100。
蛋白酶K（proteinase K）贮存液：蛋白酶K 20 mg/ml溶于50%甘油中，于-200C贮存。
耐热DNA聚合酶（如Taq聚合酶）与相应的10X TAE缓冲液（见附录A1）琼脂糖（分子生物学级）；溴乙啶（10mg/ml溶于水中并避光保存）。
6X加样染液（40%甘油、0.125%溴酚蓝和125mmol/L EDTA）.DNA分子量标志（50ng/ml）、pBR322 DNA。
DNA扩增仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪（UV）、加样枪、PCR管（0.5ml 或0.2ml）。
方法与步骤1) 样品制备（1）将106细胞悬液或贴壁细胞刮下来的悬液放1.5ml微离心管内，以最大转速离心15min。
（2）弃去上清，将细胞再悬浮于100ul裂解液中，然后加蛋白酶K，使终浓度为60ug/ml。
（3）置微波炉内600C孵育1h，然后升至950C 10min，再将样品置室温中降温。
2) PCR扩增（1）在冰浴中对各样品制备PCR重要混合物，对每个样品均加入：10X PCR缓冲液5.0ml25mmol/L dNTPs 混合物0.4ul40umol/L 16sr DNA引物每种引物1.0ul40umol/L pBR322 DNA 引物每种2.0ulpBR322 DNA 1pg/ml 2.0ulDNA聚合酶（5U/ml）0.2ul三蒸水35.4ul总量45ul（2）用无菌去离子水稀释样品为1:10，1:100。
（3）于每个eppendorf管中加45ul PCR扩增混合物，每管中分别加入样品原液及1:10，1:100稀释液各5ul，操作均在冰浴中进行。
（4）在每个eppendorf管中轻轻加入50ul无菌矿物油，覆盖在液面上。
如DNA扩增仪带有有制式热盖，此步骤可省略。
（5）将各管放入DNA扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令：① 950C 10min 一个循环② 950C，30S→580C 1min→720C 1min, 共30个循环。
③最后720C 10min延长循环。
3）PCR产物分析（1）制备含有EB染料（0.1ug/ml）的1%琼脂糖凝胶（用TAE缓冲液制备）（2）从PCR扩增仪中取出样品管，取10ulPCR扩增产物加到2ul带有染液的加样液中，混匀后加样到琼脂糖凝胶加样孔中，同时在对照孔中加10ul标准DNA分子量标志。
（3）凝胶置TAE缓冲液中，电压80V，电泳60-90min。
（4）凝胶电泳完毕，将凝胶置紫外透射仪下观察，有无被EB染料着色的红色荧光DNA条带，样品孔与标准DNA孔进行比较并拍照。
质控与提示1）阳性对照（1）如果支原体DNA可查到，则10ngDNA即呈阳性结果。
（2）如得到已知支原体感染的细胞培养，细胞可同样品一样处理，作为阳性对照，处理的细胞置-200C冻存，可重复使用。
2）阴性对照（1）用45ul PCR扩增液加5ul 无菌去离子水混匀，作为阴性对照。
（2）在含45ul PCR扩增液的eppendorf管中建立一个对照孔，以2ul无菌去离子水替代pBR322 DNA（1pg/ml）。
（3）有时样品中可能含有聚合酶的抑制物，可阻抑PCR扩增，这种情况很易被pBR322扩增片段的缺失所识别。
遇此情况是，应从同一培养物中另取少量细胞（105个）重新制备一份样品，如果这样做仍无扩增片段出现，就将细胞在无抗生素的培养基中试生长2-3周，然后再作支原体检测。
因为抗生素能结合双链DNA，故有人怀疑抗生素具有抑制Taq聚合酶的活性。
2． DNA荧光染色法原理DNA荧光染色法是以Hoechst或4／-6-二氨基-2苯基吲哚（4／-6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）试剂为荧光染料，使支原体DNA着色，用荧光显微镜在感染的靶细胞的胞质中辩认出荧光，证明试验样品中存有支原体。
试剂与仪器●靶细胞CKI－1（IFO5003，JCRB0008）或Vero细胞（ATCC CCL82）●试验样品约106个细胞的培养上清液1ml●支原体mycoplasma hyorhinis (ATCC 29052) M.orale(IFO 14477)●培养液MEM＋10％FBS（无抗生素）无钙镁PBS 固定液；甲醇：醋酸为3：1●荧光染液①浓缩染液（100mlPBS中加Hoechst Dye 5mg 防腐剂thimerosal 10mg 用磁力搅拌器助溶30min，每瓶分装1ml，严格避光保存于－20℃冰箱内）②使用液：将冻存的浓缩液取0．15ml加入100mlPBS中，（最终浓度为0.075μg/ml的Hoechst Dye 0．15μg/ml的thomerosal 防腐剂）用磁力搅拌器搅拌助溶30min，使色素完全溶解。
（使用前调制）●荧光显微镜、各种吸管、60mm玻璃平皿、10ml离心管、4 个带有可活动玻片的培养皿、盖玻片（无荧光）方法与步骤（1）检验材料的制备①检体细胞的培养：被检细胞在不含有抗生素的培养中传代培养3次以上（不低于3次）在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液，经2－3天培养。
②细胞回收：培养细胞上清液，以及用橡胶刮匙从培养皿上刮上的细胞，吸入离心管内，于4℃下，1200r/min,离心10min。
吸弃上清，留下约含106个及大约1ml上清液。
③冻融：将离心细胞收集到冻存管内置－20℃冻结，30min后置37℃孵箱内融解，如此反复操作2次，于4℃1200r/min离心10min,吸取上清液作为检体。
（2）标记靶细胞培养与检体的接种①将液氮（－196℃）冻存的CKI－1或Vero细胞解冻（37℃1分钟内迅速解冻）计数活细胞达2－3×103／ml，植入4个带有可活动的切片在皿底的培养皿中，每培养皿1ml，置CO2孵箱内培养。
②孵育24h后在显微镜下见细胞呈适当的密度（高倍镜下见160－240个细胞／视野）时，弃去培养液，于每个带可活动切片平皿内换新鲜培养液0．9ml，在i号皿内接种冻融检体0.1ml 在ii号皿内加0.1ml培养液，作为阴性对照，iii与iv号皿内加入100cfu/0.1ml的M.hyorhinis 和M.orale支原体液，作为阳性对照。
将4个培养皿置CO2孵箱内培养6天。
（3）细胞固定、染色、封片观察①吸弃培养液，用CMF－PBS洗涤细胞加在可活动玻片上1ml固定液，固定10min。
②吸弃固定液，风干后各加染色液ml置室温染色30min。
③吸弃染色液,用蒸馏水洗3次，取下可玻片的杠架和垫圈，取下可活动玻片。
④滴入封片液，其上复上盖玻片并赶除气泡和多余的封片液，四周用封片胶封闭。
⑤启动紫外系统，用荧光显微镜观察（放大约×400－600适宜）（4）结果判定①在细胞质中观察有无荧光，试验样品与阳性、阴性对照对应观察。
②计数1000个细胞，有5个以上的细胞质中见荧光着色，可判定为阳性。
质控与提示（1）标记的靶细胞除CKI－1和vero细胞外，3T6细胞（ARCCCCL96）也可使用。
本法成功的要点之一是用作靶细胞质控的管理应严格，必预先确认该细胞无支原体的污染才能冻存使用。
（2）要明确本检体的结果判定，必须使用不含抗生素的培养液。
（3）染色液：Hoechst染液不稳定，故每次检测前须新鲜配制，使用DAPI也可以，均应新鲜配制。
（4）试验检体：被试细胞回收时用橡胶刮匙刮下,不能用胰蛋白酶等水解酶类消化，制备好的检体细胞保存在－80℃冰箱中可存放数月。
（5）阳性对照：本试验采用支原体M.hyorhinis和M.orale为阳性对照，要十分注意避免有新的污染源。
（6）特异性与敏感性：本法不是支原体的特异性检出法，对DNA进行染色观察，对其他微生物（细胞内寄生的霉菌、细菌等）的污染，也可看出同样的荧光染色，甚至检体会含有细胞的DNA颗粒，都是引起结果判定混乱的原因。
但细胞培养所污染的支原体，M.hyorhinis、M.orale、M.salivarium、M.hominis、M.fermentans等约占支原体污染的97％，本法针对这些支原体污染的检出敏感度为1cfu，而一般污染细胞中的支原体浓度为103－108cfu/ml，故本法仍具有很好的实用性。
（二）支原体的去除由于支原体对细胞培养的交叉污染严重并在无意识之中发生，故对支原体检测为阳性的细胞株应丢弃；只对某些贵重的细胞株而言，才设法去除支原体。
常用方法有药物法、免疫法、稀释法、加热法等。
从感染的细胞系中去除支原体较简单的方法是用阻碍支原体DNA或RNA合成的抗支原体类抗生素处理细胞。
普遍的抗生素在细胞培养液中对支原体是无效的。
而用于去除支原体的药物均为喹诺酮类和/或四环素类抗生素的衍生物。