工具酶(限制性内切酶)优秀PPT
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• 一般认为这些酶主要以单体的形式结合到 DNA 上，与邻近酶分子的切割功能 域结合成二聚体，协同切开 DNA链。因此一些ⅡS 型酶在切割含有多个识别位 点的 DNA 分子时活性更高。
FokI
10
Ⅲ 型限制性内切酶
• 也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。 它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要 求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列 以完成切割。
4
限制和修饰（R -M ）的类型至少存在 4 种不同类型的 R M 系统：类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。它们之间的主要差异总结 在表 3.1 中。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，
传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内 切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
18
限制性内切酶命名
• ① 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。微生物属 名的首字母大写，种名的前两个字母小写。
3
Ⅱ型限制内切酶的发现
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。
4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
8
最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
1. 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化 酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
2. 但也有少量的酶与DNA 结合形成异二聚体，识别非对称序列（如 BbvCI 识别 CCTCAGC）。
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
5
Hale Waihona Puke Baidu
6
Ⅰ型限制性内切酶
• 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋 白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。
• 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研 究中很有意义，但其不
• 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因 而不具备实用性。
7
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
• 经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌 （Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分 子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度 和序列一定的分离片段。
内切酶,现已成为重组DNA技术的重要工具。
2
限制和修饰现象
• 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。
• ② 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母, 但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶，依发现和分离的前 后顺序用罗马数字区分。
一、工具酶
• 到 20 世纪 60 年代中期，人们已经认定限制 和修饰是细菌遗传学领域中最重要和最有趣 的现象（例子可见 Hayes，1968），但是谁 会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响 呢？
• 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？
1
寄主的限制与修饰有两方面的作用。一是保护自身的DNA不受限制，二 是破坏外源 DNA, 使之迅速降解。根据限制-修饰现象发现的限制性核酸
• 这类酶很少能达到完全切割。
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某些识别和切割独特的酶
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BsmBⅠ
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Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
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15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
3. 一些酶识别连续性序列（如 EcoRI 识别 GAATTC，其中的两个半识别 序列是相连的）；
4. 而另一些识别非连续性序列（如 BglI 识别CCNNNNNGGC，其中的两 个半识别序列是不相连的）。
9
另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
• 所谓的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大 小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。 它们识别连续的非对称序列。
FokI
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Ⅲ 型限制性内切酶
• 也是一类较大的兼有限制-修饰两种功能的酶。 它们在识别位点之外切开 DNA 链，并且要 求同一 DNA分子中存在两个反向的识别序列 以完成切割。
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限制和修饰（R -M ）的类型至少存在 4 种不同类型的 R M 系统：类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。它们之间的主要差异总结 在表 3.1 中。按照亚基组成、酶切位置、识别位点和辅助因子等不同，
传统上将限制性内切酶分为四大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内 切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则远远不止四类。
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某些识别和切割独特的酶
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限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
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限制性内切酶命名
• ① 以限制性内切酶来源的微生物的学名来命名，多采用三个字母。微生物属 名的首字母大写，种名的前两个字母小写。
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Ⅱ型限制内切酶的发现
突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌 （Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶 （Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的 核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。
4. 只有当镁离子存在时，它们才有切割活性，
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最常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
1. 在特异性识别序列内部切割 DNA，如 HhaI、HindIII 和 NotI，商业化 酶多属此类。它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
2. 但也有少量的酶与DNA 结合形成异二聚体，识别非对称序列（如 BbvCI 识别 CCTCAGC）。
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
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Hale Waihona Puke Baidu
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Ⅰ型限制性内切酶
• 是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多亚基蛋 白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。
• 以前认为Ⅰ型限制性内切酶很稀有，但基因组测序 分析发现这类酶其实很常见。尽管Ⅰ型酶在生化研 究中很有意义，但其不
• 能产生确定的限制片段和明确的凝胶电泳条带，因 而不具备实用性。
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Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
• 经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌 （Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分 子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度 和序列一定的分离片段。
内切酶,现已成为重组DNA技术的重要工具。
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限制和修饰现象
• 在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该 研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制 性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分 离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操 作的前景。但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是 结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的 （Yuan 等，1980）。
• ② 若该微生物有不同的变种或品系，则再加上该变种或品系的第一个字母, 但需大写；从同一种微生物中发现的多种限制性内切酶，依发现和分离的前 后顺序用罗马数字区分。
一、工具酶
• 到 20 世纪 60 年代中期，人们已经认定限制 和修饰是细菌遗传学领域中最重要和最有趣 的现象（例子可见 Hayes，1968），但是谁 会预见到限制酶将对生物学产生的巨大影响 呢？
• 那么，什么是限制酶？限制酶来自哪里呢？
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寄主的限制与修饰有两方面的作用。一是保护自身的DNA不受限制，二 是破坏外源 DNA, 使之迅速降解。根据限制-修饰现象发现的限制性核酸
• 这类酶很少能达到完全切割。
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某些识别和切割独特的酶
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BsmBⅠ
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Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
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• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
3. 一些酶识别连续性序列（如 EcoRI 识别 GAATTC，其中的两个半识别 序列是相连的）；
4. 而另一些识别非连续性序列（如 BglI 识别CCNNNNNGGC，其中的两 个半识别序列是不相连的）。
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另一种比较常见的 Ⅱ 型限制性内切酶
• 所谓的ⅡS 型酶，如 FokI 和 AlwI，它们在识别位点之外切开 DNA。这些酶大 小居中，约 400-650 个氨基酸，由 DNA 结合域和切割 DNA 的功能域组成。 它们识别连续的非对称序列。