显微镜的使用、细菌单染色及革兰氏染色

实验三显微镜的使用、细菌单染色及革兰氏染色

姓名：贾晓霖

学号：201000140032

班级：生科10.1

同组者：李江湲程子修洪钧烨

一、实验目的

1、学习显微镜（油镜）的使用方法。

2、学习微生物制片及染色技术。

3、认识细菌的形态特征。

4、了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色法。

二、实验原理

原理一：单染色法

单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。

原理二：革兰氏染色法

革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 ％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。

三、实验器材

1、菌种

大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，自选菌。

2、溶液和试剂

革兰氏染液，结晶紫染液，碘液，95﹪乙醇，番红复染液等。

3、仪器和其他用品

酒精灯，载玻片，显微镜，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，接种环，试管架等。

四、内容

1、显微镜构造及使用

油镜的使用法：

1、使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，使载物台倾斜，以免香柏油流溢，影响观察，污染台面。

2、对光：

首先打开光圈，转动反光镜，使光线集中于集光器。可根据需要，上下移动集光器和缩放光圈，以获得最佳光度。本次实验用油镜检查染色标本，光度宜强。应将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，集光器上升至与载物台相平。

3、调焦距：

A、将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将载玻片移至接物镜下。先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴香柏油一滴，再换油镜观察。

B、转动粗调节器使载物台缓缓上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。

C、双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。

2、单染色（说明一下我做的是金黄色葡萄球菌）

1．洗片将载玻片用去污粉充分清洗。

2．干燥将涂片于室温中自然干燥。

3．涂片、固定在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，点燃酒精灯，在火焰旁边从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀。手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手背试涂片反面的热度，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。

4．染色将涂片置于水平位置，滴加结晶紫染液覆盖于涂菌处，染色1-2min。

5．水洗、干燥倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片反面上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。放于室温中自然晾干。

6．镜检待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。附：实验照片

显微镜下观察到的金黄色葡萄球菌（单染色法）

（二）细菌的革兰氏染色

1．洗片将载玻片用去污粉充分清洗。

2．干燥将涂片于室温中自然干燥。

3．涂片、固定在载玻片上交错滴四滴蒸馏水，分别标记金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和自选菌。然后仿照单染色步骤，分别在四处蒸馏水标记的位置加入少量相应的菌种，然后在火焰上固定。

4．初染于制片上滴加结晶紫染液，l.5min后，用水洗去剩余染料。

5．媒染用碘液冲洗载玻片正面，lmin后水洗。

6．脱色滴加95%乙醇脱色30s，水洗。

7．复染滴加番红，复染l.5min，水洗干燥。

8．镜检革兰氏阳性菌染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。

附：实验照片

左一：金黄色葡萄球菌（由于像素不够高，未能清楚看到聚集的球状细胞个体）

左二：大肠杆菌

右二：枯草芽孢杆菌

右一：自选菌（短杆状个体，目测为革兰氏阳性菌）

五、实验总结

选菌属革兰氏阴性菌。但是金黄色葡萄球菌紫色染色并不十分明显，可以归因于结晶紫及碘液染色时间不足。

附：3H铅笔绘图