分子生物学常用检测技术

二、核酸分子杂交
根据核酸变性和复性 的原理，不同来源的 变性单链核酸分子在 合适的条件下，通过 碱基互补形成双链杂 交体的过程称为核酸
分子杂交
（molecular hybridization）。
核酸分子杂交的临床应用
• • • • •
1、遗传病的诊断 2、病原体的鉴定 3、癌基因突变的检测 4、组织配型 5、亲子鉴定
或
2+
和
dCTP dGTP dTTP dATP 模板 引物
PCR的种类
• 荧光定量PCR
• 通PCR • 原位PCR
• 免疫PCR
• ……
荧光定量PCR
TaqMan探针
forward primer
R
5' 3'
probe
Q
3' 5' 3' 5'
5'
三、基因芯片技术
• 基质材料分， 有尼龙膜、玻 璃片、塑料、 硅胶晶片、微 型磁珠等。
用点样法固定 在玻璃板上的DNA 探针阵列
原位合成法在玻璃等 硬质表面上直接合成 的寡核苷酸探针阵列
基因芯片技术的应用
1、药物筛选和新药开发 2、疾病诊断 3、环境保护 4、司法 5、现代农业
四、测序技术
（一）一代测序技术
平台期
指数增长期 循环数Cycle Number
CT = - k logN0 + b
PCR的临床应用
对病原微生物核酸进行快速检测
弥补免疫检测的缺陷 缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） 用于药物疗效监测和评估 用于肿瘤基因表达方面的研究
用于遗传病的诊断
样本采集要求
项目
HBV HCV EB CMV
分子生物学常用检测技术
及临床应用
DNA—四种核苷酸（A-T-C-G)组成 的多聚骨架
所有组成DNA的核苷酸 dATP,dTTP, dCTP,dGTP 都由三种成分组成： 1）一个2’-脱氧核糖（戊糖） 2）一个含氮碱基 嘌呤：A\G 嘧啶： T/C 3）三个磷酸基团 各单个核苷酸由5’和3’-碳形 成的磷酸二酯键连接在 一起
CTTGATCTTCAGGTAGGCCTGAATCCT
（二）二代测序技术
• Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大
的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的。
• Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边 测序。 • 在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色 的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时， 每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光 信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序
定量PCR的数学原理
PCR 理 论 方 程
N = N0 x (1+E)n
Log [DNA]
线性增长期Linear
平台期Plateau
y = N0 (1+e)n
指数增长期Geometric
N：扩增数量 N0：起始模板数量 E：扩增效率 N：循环数
循环数
定量PCR的数学原理
Rn (荧光强度)
Ct （Cycle threshold）值： 是指每个反应管内的荧光信 号到达设定域值（threshold） 时所经历的循环数。
TB
MP 咽拭子 呼吸道病毒
项目 CT NG UU TP
标本采集
所需容器
男性： 一次性无 尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道约 菌带盖的 2～4厘米，旋转数圈取出分泌物（应略 试管。 带粘膜）。 前列腺液、精液。
HPV
HSV
女性： 阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去宫 颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈 内，停5秒后旋动棉拭子采取分泌物。 尿道分泌物：同上
小结
分子生物学技术的临床应用
感染性疾病诊断 肿瘤性疾病诊断 遗传性疾病诊断 组织配型和器官移植
• 疾病的诊断
– – – –
标本采集
无菌注射器抽取2毫升静脉血或其它体液注入无 菌试管或抗凝管。 1.鼻咽拭子或体液标本。 2.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。 1.尿液：中段晨尿20ml于加盖试管。 2. 其他体液标本或咽拭子。 3. 也可取抗凝血标本,但一般不推荐。 1.痰液：患者深部咳痰1～3ml于无菌加盖试管。 2.其他组织标本：留于无菌试管。 3.也可取抗凝血标本,但一般不推荐。
1. Polymerisation
reverse primer
Q
5' 3' 5'
3' 5' 3' 5'
2. Strand displacement
R Q
5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5' 3'
R
Q
3. Cleavage
5' 3' 5'
4. Polymerisation completed R = Reporter Q = Quencher
变性、复性、退火和淬火
基因
分子生物学常用技术
1. PCR（聚合酶链式反应） 2. 核酸分子杂交 3. 基因芯片技术(biochip) 4. DNA 测序（DNA sequencing ） 5. DNA重组技术(DNA recombination)
一、聚合酶链反应
（Polymerase Chain Reaction ，PCR）
列信息。
技术特点比较
• 第一代测序技术的主要特点是测序读长可达 1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高 ，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规
模的应用。
• 第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还
大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，但
在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多
体外基因扩增技术
特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术
（一）PCR原理
原理 双链DNA 变性 退火 链延伸
（DNA合成） （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交）
不断重复
（二）PCR反应的设计及影响因素
PCR反应体系
Mg Mn
2+
和
Taq DNA 聚合 酶
。
五、基因重组技术
• 基因重组是指一 个基因的DNA序列 是由两个或两个 以上的亲本DNA组 合起来的。
• 基因重组是遗传 的基本现象，病 毒、原核生物和 真核生物都存在 基因重组现象。
基因重组技术的应用
• 转基因植物
• （抗虫、抗冻、抗病、高产）
• 转基因动物
• 基因工程药物和疫苗
• 基因治疗