生物膜胞外聚合物的研究_蒲晓芬

生物膜中胞外聚合物 （ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ， ＥＰＳ） 附着在细菌表面或围绕在细菌周 围， 水道、孔隙穿通其间， 就形成了特征性的蘑菇状 生物膜结构。ＥＰＳ 与胞外基质（ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ） 是一个概念， 主要来源于细菌的分泌、细菌表面物 质的脱落、细菌溶解以及对周围环境物质的吸附。 ＥＰＳ 由多种有机物组成， 包括多糖、蛋白质、核酸、 磷脂、褐藻酸、腐质等， 主要是多糖和蛋白质。ＥＰＳ 在细菌微生物群体中广泛存在， 在细菌的粘附聚 集 、空 间 构 型 、细 菌 间 信 息 交 流 、耐 药 性 、抗 毒 性 等 方面起着重要作用。本文就近年对 ＥＰＳ 的研究内 容作一综述。
７ 参考文献
［１］ Ｎｅｕ ＴＲ ， Ｋｕｈｌｉｃｋｅ Ｕ， Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＪＲ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２００２， ６８（ ２） ： ９０１－ ９０９．
［２］ Ｍｅｒｒｏｕｎ ＭＬ， Ｂｅｎ Ｃｈｅｋｒｏｕｎ Ｋ， Ａｒｉａｓ ＪＭ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈ－ ｅｍｏｓｐｈｅｒｅ， ２００３， ５２（ １） ： １１３－ １２０．
国外医学口腔医学分册 ２００５ 年 ９ 月第 ３２ 卷第 ５ 期
· ３４１ ·
影响生物膜消除的因素有营养底物、ｐＨ 值、流 体剪切力、细菌间信号交流等。对格氏链球菌研究 中发现痕量元素铜也能影响生物膜的崩解， 机械 法、化学法（ 如十二烷基硫酸钠） 对消除生物膜有积 极作用， 此外有报道称电流即可诱导手术不锈钢器 械 上 表 皮 葡 萄 球 菌 生 物 膜 的 崩 解［１１］。
ＥＰＳ 是带负电荷、高度含水的凝胶状基质， 能 较长时间固存微生物， 利于形成稳定的互生微菌 落。ＥＰＳ 在紧密粘着的凝胶体状态或非常松散的粘 液或溶液状态均可存在。用粘度计和核磁共振研究 铜绿假单胞菌 ＳＧ８１ 生物膜的流变性， 发现生物膜 呈一种固态的粘弹性， 室温下弹性大于粘性， 弹性 随温度的升高而降低［５］。从生物膜中单独提取 ＥＰＳ， 其粘性在持续剪切力下不随 时间变化， 说明 ＥＰＳ 具有凝胶的触变性和抗流变性。ＥＰＳ 是一种适应性
４ ＥＰＳ 的生物学作用
４．１ 对细菌粘附的影响 ＥＰＳ 有利于细菌粘附聚集到载体界面， 尤其是
对细菌粘附到固体表面的初粘阶段。ＥＰＳ 改变了微 生物群表面的电荷、疏水性及聚合物属性等物理 化学特性， 有助于细菌对固体表面的粘附。从废水ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ处理器提取了 ２７ 种异养菌， 研究细菌对玻璃珠的 粘附中 ＥＰＳ 的影响， 结果证实如果 ＥＰＳ 含量较少， 细菌粘附到固体表面就会受到静电作用力的抑 制； 如果 ＥＰＳ 含量较多， ＥＰＳ 聚合物就会加强细菌 的粘附。原子力显微镜技术研究证实， 蛋白样的 ＥＰＳ 参与了固氮螺菌属粘附到固体表面的过程。金 黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所合成的 β－ １， ６ 键 糖胺聚糖体是一种多糖性质的细菌间粘结素， 能 促进细菌间粘附， 是生物膜形成所必须的。而在口 腔致龋菌中变形链球菌产生水不溶性和水溶性葡 聚糖， 水不溶性葡聚糖促进细菌粘附聚集， 影响生 物膜的结构； 水溶性葡聚糖作为代谢底物， 产酸供 能， 促进水不溶性葡聚糖的合成。 ４．２ 对生物膜结构的作用
２ ＥＰＳ 的物理性质
ＣＬＳＭ 用 于ＥＰＳ 的 定 量 研 究 是 基 于 生 物 膜 中 的固体质量 （ Ｓｖ） 由 ＥＰＳ 质量 （ ＳＥＰＳ） 和细菌质量 （ Ｓｃｅｌｌ） 组成这个假设。有 ＳＶ＝ＳＥＰＳ＋Ｓｃｅｌｌ， Ｚｈａｎｇ 等 根 据 文 献 资 料 把 该 公 式 变 换 为 ＳＥＰＳ＝ＳＶ－ ０．４４Ｖ 这 个 等 式 ［４］， ＳＶ 用 标 准 的 方 法 （ＡＰＨＡ １９９２） 检 测 ， 而 用 ＣＬＳＭ 逐 次 扫 描 生 物 膜 全 部 区 域 的 每 个 层 次 的 面 积， 这些所有面积之和即为整个生物膜的体积 Ｖ。 研究 ＳＥＰＳ 和 Ｓｃｅｌｌ 随时间变化的趋 势， 证实二者都随 细菌生长时间的延长而增加， ＳＥＰＳ 增加更明 显。生 物膜中 ＥＰＳ 的组成及含量取决于细菌种类、生物 膜的生长时间和各种各样的环境因素， 这样就体现 了生物膜的时间动态性和空间的多样性。
国外医学口腔医学分册 ２００５ 年 ９ 月第 ３２ 卷第 ５ 期
· ３３９ ·
生物膜胞外聚合物的研究
蒲晓芬综述 胡 涛， 周学东审校 （ 四川大学华西口腔医院牙体牙髓病科 四川 成都 ６１００４１）
［摘要］ 生物膜胞外聚合物是生物膜中围绕在细菌周围的高度含水的多聚大分子， 其组成和物理 化 学 属 性 决 定 生 物 膜 的 粘 附 、构 型 及 生 物 学 特 性 。 近 年 来 国 内 外 学 者 对 生 物 膜 胞 外 聚 合 物 的 空 间 结构、物理化学属性、生物学作用及消除方法进行了很多研究。本文就相关研究的最新进展作一综 述。 ［关键词］ 胞外聚合物； 生物膜 ［中图分类号］ Ｑ７３ ［文献标识码］ Ａ
［收稿日期］２００５－ ０３－ ０１； ［修回日期］２００５－ ０６－ ２１ ［作者简介］蒲晓芬（ １９７６－ ） ， 女， 四川人， 硕士研究生 ［通讯作者］胡 涛， Ｔｅｌ：０２８－ ８１８０２６０２
的聚合凝胶状结构。镧固定处理黄色粘球菌后用透 射电镜观察发现， ＥＰＳ 围绕在细菌周围并呈高电子 密 度 的 纤 维 网 格 状 结 构［２］。 电 镜 对 非 磷 酸 合 成 异 养 菌的观察，证实生物膜中 ＥＰＳ 是各种微生物产生的 空间结构多样化的基质， 并且相互间有明显的分隔 界 限［３］。
ＥＰＳ 可以帮助细菌抵制抗生素、有毒金属、氯 化物等不利因素， 其确切的机制尚不清楚， 可能与 ＥＰＳ 直接吸附有毒制剂、降低细菌的生长率、加强 含抑制因子质粒的水平信号传导等有关。在牙菌斑 生物膜中， 变形链球菌产生的胞外多糖能帮助细菌 躲避人类中性白细胞的吞噬。
５ ＥＰＳ 的消除方法
ＥＰＳ 是生物膜的重要组成部分， ＥＰＳ 的消除与 生物膜的消除密不可分。生物膜的消除包括细菌的 离散和 ＥＰＳ 的崩解， 两者的因果关系和具体的机 制尚不清楚。目前相关的机制研究有酶假说、饥饿 假说。变形链球菌 ＮＧ８ 有一种外源性的表面释放 蛋白酶， 该酶能释放一种表面蛋白如粘附素 Ｐ１ 参 与生物膜的崩解 ［７， ８］。伴放线放线杆菌能产生一种 外 源 性 由 ｄｓｐＢ 编 码 的 氮－ 乙 酰 基－ 葡 糖 基 氨 基 酸 酶亦即 ＤｓｐＢ， 该酶能导致细菌的离散和基质栅栏 结构的崩解［９］。生物膜微环境中氧压、ｐＨ 值、温度、 营养浓度等条件的变化可诱发伴放线放线杆菌的 ＤｓｐＢ 产生。一种观点认为 ＤｓｐＢ 底物是四型菌毛， 因而影响伴放线放线杆菌的粘附和解聚集； 另一种 则认为 ＤｓｐＢ 的底物是胞外多糖， 多糖被 ＤｓｐＢ 水 解， 从而多糖基质降解， 细菌离散。ＤｓｐＢ 这一作用 类似于铜绿假单胞菌的褐藻酸裂解酶， 即通过胞外 多糖解聚酶的方式崩解 ＥＰＳ。此外， Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 生 物膜 ＥＰＳ 的成分 Ｃｏｌａｎｉｃ ａｃｉｄ 对生物膜复杂 的三 维结构和厚度的形成必不可少。对生长期小于 ６０ ｈ 的生物膜， 使用 ＤＮＡ１ 酶处理后， 发生定植微生物 的离散， 说明胞外的 ＤＮＡ 在生物膜形成的早期可 能参与了结构的形成。通过酶 的方法来控制 ＥＰＳ 对 移 除 或 稳 固 生 物 膜 可 能 是 个 好 方 法 。饥 饿 假 说［１０］ 认为铜绿假单胞菌生物膜中营养底物消耗， 饥饿环 境诱发了生物膜的崩解及细菌的离散。
ＥＰＳ 可吸附金属、非金属、大分子物质， 能与许 多 金 属 离 子 Ｃｄ２＋， Ｃｕ２＋， Ｃｒ２＋， Ｐｂ２＋螯 合 形 成 单 价 、双 价、多价阳离子与 ＥＰＳ 阴离子相结合的复合物。结 合强度受离子大小／电荷的比值、ＥＰＳ 组成、物理状 态、ｐＨ 值、离子盐溶液等影响。ｐＨ 低时， 从结合状 态释放离子， 高 ｐＨ 时， 离子被螯合。ＥＰＳ 中蛋白质 和 多 糖 上 阴 离 子 官 能 团 ， 如 羧 基 、磷 酸 基 团 、硫 酸 基 团 、甘 油 酸 基 团 、丙 酮 酸 基 团 、琥 珀 酸 基 团 均 可 参与金属离子的螯合。凝胶状态的 ＥＰＳ 比粘液状 态的 ＥＰＳ 对金属的粘附更强。另外紫外线能增加 ＥＰＳ 中羧基的数量， 而促进离子螯合。
１ ＥＰＳ 的形态结构
激 光 共 聚 焦 显 微 镜（ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ， ＣＬＳＭ） 与不同荧光探针合用， 对生物膜 的成份进行原位非损伤性观察， 不仅揭示了生物膜 的结构呈三维蘑菇状， 其间布满水道、孔隙， 而且发 现该结构呈现空间和时间的多样性。生物膜中 ＥＰＳ 的分布和组成极大地影响着这种多样性。多光子共 聚 焦 镜 能 观 察 到 标 本 的 层 次 是 普 通 ＣＬＳＭ 的 １０ 倍， 更有 利 于 观 察 生 物 膜 深 层 的 ＥＰＳ 分 布 特 征 。 Ｎｅｕ 等［１］比 较了传统单量子 ＣＬＳＭ 和 双 光 子 ＣＬＳＭ （ｔｗｏ－ ｐｈｏｔｏｎ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ， ２Ｐ－ ＬＳＭ）的 差别， 证实了这一结论。原子力显微镜和傅里叶变 换红外光谱仪可以完整地观察到 ＥＰＳ 呈高度含水
［３］ Ｋ%ｍｐｅｒ Ｍ， Ｖｅｔｔｅｒｋｉｎｄ Ｓ， Ｂｅｋｅｒ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２００４， ５７（ １） ： ５５－ ６４．
［４］ Ｚｈａｎｇ Ｔ， Ｆａｎｇ ＨＨＰ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ， ２００１， ２３（ ５） ： ４０５－ ４０９．
· ３４０·
的基质， 能根据环境的变化不断地进行重组， 以提 高适应性。
３ ＥＰＳ 的化学性质
ＥＰＳ 由多种有机大分子物质组成， 多糖和蛋白 质占主要成分。对 ２７ 种异养需氧菌 ＥＰＳ 的组成进 行 研 究 ， 发 现 多 糖 和 蛋 白 质 占 整 个 ＥＰＳ 质 量 的 ７５％～８９％。ＥＰＳ 由细菌在生长过程中分泌， 具有极 度多样化的特性。相对分子质量处于几千到几百 万范围内， 分子结构还带有各种各样的官能团， 如 羧 基 、氨 基 酸 、磷 酸 基 等［６］。
粘性铜绿假单胞菌产生的多糖聚合物褐藻酸
国外医学口腔医学分册 ２００５ 年 ９ 月第 ３２ 卷第 ５ 期
是生物膜 ＥＰＳ 的重要成分， 在决定生物膜结构中 起着重要作用。由铜绿假单胞菌产生的粘性野生生 物膜可形成复杂的蘑菇状或突起状结构， 而非粘性 变异菌株则形成扁平补丁样的生物膜。在褐藻酸过 度表达的非粘性的野生铜绿假单胞菌生物膜也可 以看到这种复杂的蘑菇状或突起结构。另外醋酸菌 属与一些肠道菌属能产生一种水不溶性的胞外多 糖细菌 纤维素（ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ） ， 它 是 一 种 β－ １，４ 键 的 葡 聚 糖 ， 该 物 质 与 菌 毛（ ｃｕｒｌｉ ｆｉｍｂｒｉａｅ） 协 同 网 络 细 菌， 具有稳定生物膜结构的作用。 ４．３ 对细菌耐药性的影响
６ 结束语
ＥＰＳ 中研究最多的是多糖， 但是由于不同菌 种在 不 同 的 培 养 条 件 下 产 生 的 ＥＰＳ 呈 现 多 样 化 ， 使得多糖品种多结构不典型， 由于本身呈高度分 支， 并有广泛的多样化联接和侧支基团， 且 ＥＰＳ 从 细菌上分离和提取较困难， 造成多糖分析较困难。 而 ＫｃａＭ（ＫＥＧＧ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍａｔｃｈｅｒ）软 件［１２］是 一 个专门分析糖链结构的软件， 用户可以在网上根据 选项查看多聚糖的树枝状结构图， 同时该软件还配 有注解等多项功能。目前胞外聚合物研究多集中在 工业生产、食品制造、污水处理、医学行业， 在口腔 医学领域中对变形链球菌簇产生的胞外多糖也有 所研究。随着牙菌斑生物膜研究的不断深入， 人们 对胞外聚合物在生物膜中作用的认识也不断加深， 对生物膜生态学作用的全新认识必将有利于临床 治疗。