血涂片制备和染色

【方法学评价】
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瑞氏染液和吉姆萨染液对细胞进行染色时有各自 的显色特征，前者对细胞质和颗粒着色较好，后者对 细胞核结构显示清晰。因此将二者结合，能取长补短、 集中优势，用该混合染液对血细胞进行染色，其细胞 核、细胞质和细胞内颗粒均着色鲜艳，对比鲜明。瑞 氏-吉姆萨混合染色法是临床上广泛使用的方法。
六、血细胞显微镜计数法
草酸盐 （sodium oxalate）

草酸钠 、草酸钾、草酸铵

原理：草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从
而阻止血液凝固

用范围： 凝血象检查
肝素（heparin）
原理：低浓度时抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之间的作用，加强抗凝
血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成, 还能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子Ⅹ的作用；高浓度时 阻断凝血酶和纤维蛋白的反应 1g/L浓度的肝素钠与血液 1：10
一、采血方法
静脉采血法
部位：主要是肘静脉。还可以在：手背、内踝、股静脉，幼儿 可采用颈外静脉采血
注意事项:抽血时只能外抽不能内推，以免形成空气栓塞
皮肤采血法（毛细血管采血法） 部位：WHO推荐中指或无名指尖内侧为宜，耳垂 采血受温度影响大；半岁以下拇指或足部， 特殊人员视情况而定。 采血步骤及注意事项：应严格实行一人一针制； 穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混 入组织液，影响检验结果。用消毒干棉球擦 去第一滴血，以后流出的血液可以使用。
[试剂]
Wright染液：瑞氏染粉0.1g, 甲醇60.0ml 甲醇的作用：1、溶解瑞氏染料。2、有强大的脱水力， 可将细胞固定为一定形态，固定血膜。3、使蛋白质 沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触 表面积，提高对染料的物理吸附作用，增强染色效 果。 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无 水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g, 蒸馏水加到 1000ml。 配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。
二、抗凝剂选择

抗凝：用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些 凝血因子的活性，以阻止血液凝固 抗凝剂：能够阻止血液凝固的物质，称抗凝剂

乙二胺四乙酸（EDTA）盐
抗凝原理：螯合钙离子
使用方法：15g/L浓度EDTA
和血液 1：10
适用范围：血细胞形态、血小板计数。但影响血小板聚集
和白细胞吞噬功能所以不适合做凝血象检验及血小板功能试 验
图1-4 瑞氏染色原理示意图
[PH对细胞染色有影响]
细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电 解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电 荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中 负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此 细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清 洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀 释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导 致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成 错误。
标本的测定，将逐渐被血细胞分析仪所取代。
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【试剂】 各种不同的专用稀释液或染色稀释液。 【器材】 （1） 显微镜 （2） 微量吸管：Hb吸管：10、20μ l两刻度 ★毛细玻璃吸管：10、20μ l两刻度 一人一管，定期用水银称重法进行校正 误差应< ±1% （3）计数板：血细胞计数板，常用改良Neubauer计数板 计数板的构造： （4）血盖片 规格24mm×20mm×0.6mm， 要求：表面平整（不平整性＜ 0.002mm ），高倍镜检查无 裂痕，且本身有一定的重量。
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血细胞计数板的构造
24×20×0.6mm
1855 年 发明计数 红细胞的计数板 血细胞计数板法是 最可靠和最经典计 数技术
改良Neubauer
计数板
1 mm
计数池划线
1mm
计数池
计数池划线
美国国家标准局（NBS） 1941年规定： 计数池大方格每边长度的误差应在 ±1%内（1±0.01mm）;血盖片与计数 池间缝隙深度应在±2%以内 (0.1±0.002mm)。
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六、血细胞显微镜计数法
（一）原理 用一定的稀释液将标本作定量稀释， 混匀充入计数池中，在显微镜下计数一定 容积中的血细胞数，经换算求得每升血液 中的血细胞总数。
血细胞计数
人工显微镜计数法
自动血细胞计数仪法
直接计数法
间接计数法
半自动
（二、三分群）
全自动
（五分群）
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显微镜细胞计数法
适用方法：
优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温 适用范围：红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白测定、红细
胞比积）和多种生化分析
枸橼酸盐（枸橼酸三钠）
原理：螯合钙离子
使用方法：配成109
mmol/L的浓度和血液1：9 106 mmol/L的浓度和血液1：4
适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）
【染色结果评价】

正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉 红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示 出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。 染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅 蓝色或不着色，染色过酸pH<3.5时，则呈现一片红色，白细胞 中除嗜酸性颗粒外均不着色。


染色环境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、 白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。 中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。
（二）姬姆萨染色法
[原理]
吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结 果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫 着色较好，结构显示更清晰，而胞质和中性颗粒则着 色较差。
[瑞氏染色方法]
1. 用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。
2. 加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。
3. 滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。 4. 用清水冲洗，待干后镜检。
【质量控制】
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血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落.
染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、 染色时间长些效果好。 染液不能过少，以防蒸发沉淀。 冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料 沉着。冲洗时间也不能长。 染色过淡，可复染。 染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.
五、血液细胞染色
染料：生物学染色剂，将生物组织细胞和病原 体染色，在显微镜下观察结构。 发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜 色和被染组织亲合。
碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核 的染料。如亚甲蓝、天青。
酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧 烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合 细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、 嗜酸性颗粒成分等。
复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料
细胞染色原理：
一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据。 物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等 化学作用：1.染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染 料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷 的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型， 与带正电荷的碱性物质结合。 2.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同 数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其 它活性基团。在游离状态时， -NH2获得一个H+变成 带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的COO-。分别与不同染料结合。 3.周围环境的酸碱度：如环境pH＜pI（ pI 为等电 点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之， pH＞pI，则结合碱性染料。
【测定方法及评价】 将样本做适当稀释（或浓缩），充
入细胞计数池，在显微镜下计数计数板中一定体积内细胞 数，经换算得每升标本的细胞数。
如：血液 RBC 、 WBC、 PLT 、嗜酸细胞、嗜碱细胞、
淋巴细胞和单核细胞直接计数，体液细胞计数（尿中细胞管
型、精液中精子计数、脑脊液及浆膜腔积液细胞计数）等。
该法计数误差较大，费时、费力，已不能适应大批量
（一）瑞氏染色法
[瑞氏染料] 由酸性染料伊红（eosin,E-）和碱性染料亚甲蓝 (methylene blue,M+)组成复合染料。亚甲蓝为氯盐， 即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化天青。 伊红通常为钠盐。将伊红和美蓝溶解在甲醇中，即瑞氏 染料。
M+CL + NaE- → ME + NaCL 美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞氏染料）
【操作】（以血WBC计数为例）
WBC稀释液0.38ml+血20μ l
混匀后30s后灌板,静置2～3min后
以低倍镜计数四角4个大方格内WBC数
（计数原则）
计算
WBC数/L =四个大方格细胞数/4×10×20×106/L
=四个大方格细胞数×0.05×109/L
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质量控制
(一)、技术误差 1、采血部位不当 2、血液凝固 3、稀释倍数不准 4、充液不当 5、识别错误 6、器材不符合要求
2、血液涂片制备
将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片 的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。
图1-3 血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观）
[血涂片质量评价]
均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧 注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚 一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分 明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留 有空隙，血膜长度约4厘米。
[染色原理]
细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲 和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的 亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一 血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白， 嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染 粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞 浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色， 称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝 均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
[试剂]
吉姆萨染料 甘油 甲醇（AR）
1.0g 66.0ml 66.0ml
[染色方法] 1. 甲醇固定干燥血膜3-5min 2. 将血膜在染液中浸染10-30min 3. 流水冲洗,待干后镜检
（三） 瑞氏-吉姆萨染色
【原理】 将瑞特染料和吉姆萨染料按一定比例混合后对 细胞进行染色，其染色原理同瑞特和吉姆萨染色法， 但染色效果更佳，因为其综合了瑞士和吉姆萨染色 法的优点。
【瑞氏-吉姆萨染色试剂】

瑞特染料 吉姆萨染料 甲醇
1.0g 0.3g 加至500ml
先将瑞特染料和吉姆萨染料充分研磨混匀，甲 醇溶解倒入容器中，未溶解完的继续加入甲醇研磨， 重复多次，最后把染液加至500ml。
[瑞氏-吉姆萨染色方法]
血片滴加染液5滴盖满血膜，2min后加入pH6.46.8磷酸盐缓冲液（同瑞氏染液）缓冲液10滴，10min 后用流水冲洗干净，待干后镜检。
3. 血液标本检验后的处理
血源性污染是医源性污染的主要来源之一，检验后 的血液标本处理不当，其危害极大。对于检验完毕的 血液标本首先要进行高压灭菌，然后再进行无害化处 理。带有血液的检验器材要用消毒液浸泡。采血用的 注射器要进行毁形、消毒并进行无害化处理。
四： 血液涂片制备
血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方 法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液 病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪 的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结 果的简易方法。
血涂片的用途：血细胞形态学检验、网织红、
寄生虫检验。
1：玻片的清洁



将载玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20分钟， 再用热水将肥皂、血膜洗去，自来水反复冲洗， 必要时用95%的乙醇浸泡1小时，擦干备用。 新玻片常有游离碱质，用重铬酸钾洗液或稀盐 酸（浓盐酸稀释10倍）浸泡24小时，再彻底 洗涤。 使用玻片时，要手持玻片边缘，，以保持玻片 干燥、清洁、中性、无油腻。
血液一般检验 主讲人:李学民
复习 血液标本采集和抗凝剂选择
血标本：
全血：血细胞+血浆;临床血液学检查，血细胞计数、分类和形态 学检查 血浆：全血除去血细胞；血浆病理性和生理性化学成分的测定， 内分泌激素、凝血因子（钙除外）、血栓和止血检查 血清：离体后血液自然凝固后析出的液体成分（除纤维蛋白原等 凝血因子）；临床化学和临床免疫学检查，可见血浆与血清的 主要区别是，血清中不含纤维蛋白原。