分子生物学实验手册 -高校教材

实验五 质粒 DNA 限制性内切酶实验
实验目的
通过 DNA 限制性内切酶实验掌握内切酶技术。
实验原理
不同酶切反应都需要不同的酶切缓冲液。多数生物技术公司的产品目录中均 有关于何种限制性内切酶适合何种缓冲液的资料可供查阅。绝大多数酶的反应温 度是在 37℃。酶切反应时间有 30 分钟、60 分钟，以至 2 小时以上甚至过夜。 本次实验要进行的是对重组质粒 pET-22b 进行 EcoRI 酶切，重组质粒上有两个 EcoRI 识别位点。
3 取单酶切反应液 10μl 和上样缓冲液 2μl，混
匀，标准分子量 DNA 5μl，待作电泳上样液。
4 08%的琼脂糖凝胶电泳。
5 紫外灯下观察酶切琼脂糖凝胶电泳图。
琼脂糖凝胶电泳图
实验六 重组 DNA 的 PCR 扩增
实验目的
学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。
实验原理
多聚酶链式反应的原理类似于 DNA 的天然复制过程。在待扩增的 DNA 片段两 测和与其两测互wk.baidu.com的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸后，DNA 可扩增一 倍。
掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的操作技术
难点: 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验四. 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因及琼脂糖凝胶电泳 （8 学时） 基本要求:
熟悉聚合酶链反应（PCR）的基本原理、实验基本条件；了解 PCR 反应条件 的优化和注意事项和应用范围 掌握聚合酶链反应（PCR）的实验技术：了解核 酸琼脂糖凝胶电泳的原理及操作步骤，掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。
重点:
掌握质粒 DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒 DNA 的原理。进一步
了解限制性内切酶的特性，掌握 DNA 的酶切技术。
难点: 掌握质粒 DNA 的小量制备方法及 DNA 的酶切技术。
实验二. 细菌基因组 DNA 的提取
（4 学时）
基本要求:
了解细菌基因组 DNA 的提取的目的，原理，掌握细菌基因组 DNA 的提取的实
12000rpm 离心 1 分钟。
7 将吸附柱放入同一支收集管中，吸取洗涤液到吸附
柱，离心 1 分钟。
8 重复步骤 7 一次。 9 将吸附柱放入同一支收集管中，高速离心 2 分钟。
质粒电泳图
10 在吸附柱(3S)膜中央加 50μl 无菌双蒸水，室温高速离心 1 分钟。
实验三 琼脂糖凝胶电泳
实验目的
实验步骤
大肠杆菌形态图
1 感受态细胞的制备： 1) 挑菌 37℃培养。 2) 将过夜培养的细菌转接培养 2-3 小时。 3) 将菌液置冰上 10 分钟，4℃离心 8000rpm 30 秒。 4) 用氯化钙溶液悬浮菌体，冰浴，离心弃去上清。 5) 氯化钙溶液悬浮菌体。 2 转化： 1) 取出感受态细胞,试剂 A，无菌双蒸水和待转化的质粒 DNA，均置冰盒内。 2) 取离心管管一支，将质粒、试剂 A、无菌水，感受态细胞混匀冰浴 20 分钟。 3) 在管内加入 400ul LB 液体培养基，振荡培养 10-40 分钟。 4) 涂布培养。
实验步骤
PCR 反应的原理
1 在 02ml 离心管管内配制 50μL 反应体系：
（1）ddH2O
38μL
（2）10×buffer
5μL
（3）dNTP
1μL
（4）Taq 酶
1μL
（5）引物 P1
1μL
（6）引物 2
1μL
（7）模板 DNA
3μL
2 按下列程序进行扩增：
（1） 94℃预变性 5 分钟；（2） 94℃变性 50 秒；
仪器编号 20056176 20056177 20056127 20056023 20010674 20051742 20051743 20056016 20056144 20056146 20051786 20051787 84070001 20051747 20051750 20054981 20056017 20056018 20056019 20056093 20054980 20056031 20056032 20056033 84070002 84070003 84070004 84070005 84070006 20055991 20055993 20056091 20055992 20056050 20056089 20056134 20056047 20056048 20056086 20056087 20056088 20056158 20056159 20056160 20056161 20056162
内切酶酶切 DNA 示意图
实验步骤
内切酶酶切 DNA 立体示意图
1 在离心管管中以编号次序加入以下相应试剂：
（1）ddH20
45μl
（2）10×Buffer 2μl
（3）BSA 小牛血清 25μl
（4）质粒 DNA
10μl
（5）EcoRⅠ
1μl
总体积
20μl
2 37℃水浴 15 小时后，终止酶切反应。
验步骤及操作方法
重点:
掌握细菌基因组 DNA 的提取的实验步骤及操作方法
难点: 掌握细菌基因组 DNA 的提取的实验步骤及操作方法
实验三. 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验（4 学时） 基本要求:
了解大肠杆菌感受态细胞的制备原理及转化反应的目的，应用范围及操作过 程，掌握重组 DNA 质粒转化大肠杆菌的操作技术。 重点:
实验二 质粒 DNA 的提取
实验目的
本实验通过质粒快速提取试剂盒的试剂对大肠杆菌中的重组质粒 pET-22b 的 抽提，掌握质粒 DNA 的小量制备方法，了解碱裂解法制备质粒 DNA 的基本原理。
实验原理
载体是基因工程所必需的工具，它用于将目的基因运载到宿主细胞内进行克 隆与表达。常用的载体有质粒、λ噬菌体、M13 噬菌体、逆转录病毒 DNA 和昆虫 病毒 DNA 等，而质粒是最常用的载体。
质粒图谱 1
质粒图谱 2
实验步骤
1 收集菌泥。
2 悬浮细菌。
3 加入 200μl 裂解液 (Solution 2)，充分裂解菌体。
4 加入 400μl 絮凝剂(Solution 3)。
5 15000rpm 离心 10 分钟，无需低温离心。
6 将 步 骤 5 中 的 上 清 转 移 到 吸 附 柱 (3S) 中 ，
仪器名称 型号
标准型双人净SW-CJ-IC
标准型双人净SW-CJ-IC
冰箱
海尔BCD-210
超声波细胞粉JY92-II2D
电热鼓风干燥101C-3
电子天平 BS224S
南京工业大学制药与生命科学学院
《分子生物学实验》教学大纲
英文名称： Molecular biology
学分：1
学时：32
教学对象：生物工程专业、制药工程专业、药剂学专业、食品学专业、生物技术
专业
教学目的：在开设的理论课程的基础上，结合实验课程的教学，使学生能较全面 系统的掌握分子生物学的基本操作，拓宽专业知识面，加深对专业知识的理解， 强化动手能力。。
生物工程与技术基础实验与工程实训中心
分子生物学实验室
实验一 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验二 细菌质粒 DNA 的提取 实验三 琼脂糖凝胶电泳 实验四 细菌基因组 DNA 的提取与琼脂糖凝胶电泳 实验五 质粒 DNA 限制性内切酶实验 实验六 聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因 实验七 胶回收法纯化 DNA 与琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，可用于分离、鉴定和纯化 DNA 片段。胶回收是指目的 DNA 片段经由琼脂糖凝胶电泳与其它片段分离，再从琼脂 糖凝胶中将目的 DNA 片段抽提纯化出来的过程。
实验步骤
操作流程见右图 1 目的 DNA 电泳。 2 切出含有目的 DNA 的凝胶。 3 称量胶块重量，计算胶块体积。 4 向胶块中加入胶块融化液。 5 75℃加热融化胶块。 6 将溶液转移至 Spin Column 中离 心 1 分钟，弃滤液。 7 用 Rinse A，Rinse B 冲洗 Spin Column。 8 在 Spin Column 膜的中央处加入 25 μl 的灭菌蒸馏水或 Elution Buffer12,000 rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA。 9 取胶回收目的基因片段洗脱液 1 μl 加上 10×Loading Buffer 1μ l 混匀。
大肠杆菌的细胞的结构
实验步骤
细菌基因组 DNA 的结构
1 细菌的消化 2 加入 400 ul DL 液和 25 ul 蛋白酶 K，迅速温和地来回颠倒离心管彻底混匀。
温浴 30 分钟。离心 1 分钟后，取上清至另外一个离心管中。 3 加入 200 ul 异丙醇,离心弃去收集管中的液体。 4 加入 500 ul 洗涤液，离心 30 秒。 5 将吸附柱移入另外一个干净的收集管中。离心 15 秒。 6 将吸附柱放入同一个收集管中。离心 1 分钟。 7 在吸附膜中央加入 100 ul T1 液，离心 1 分钟。将 DNA -20 ℃ 保存。 8 取纯化后基因组片段洗脱液 2μl 加上样缓冲液 1μl 混匀，标准分子量 DNA2-3 μl，电泳检测结果。
重点: 掌握掌握琼脂糖凝胶电泳的实验方法。
难点: 聚合酶链反应（PCR）的实验技术，琼脂糖凝胶电泳的实验方法。
实验五. 聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质 （4 学时） 基本要求:
了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质的基本原理，学会用该法 测定蛋白质分子量的操作技术。
重点: 掌握聚丙烯酰氨凝胶的配制方法，了解聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）分
电泳图
凝胶成像系统
实验四 细菌基因组 DNA 的提取
实验目的
本实验通过利用小量细菌基因组 DNA 抽提试剂盒对大肠杆菌基因组 DNA 的抽 提，掌握细菌基因组 DNA 的小量制备方法。
实验原理
本实验使用 溶菌酶破壁及蛋白酶 K 消化以确保基因组 DNA 得率。不使用苯 酚/氯仿等有机试剂，无须传统的乙醇沉淀、洗涤、干燥、溶解过程，简化了操 作。
用来检测 DNA 的情况，如 DNA 片段分子量的大小、纯度等。
实验原理
利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准 DNA 的移动度，可测定 DNA 片段的相对分子 量。一般 800bp 以上的片段用 08%的琼脂糖凝胶，800bp 以下的片段，用 10%-20% 的琼脂糖凝胶。用溴化乙锭染色，在紫外灯下可以直接确定并分析 DNA 片段在凝 胶板中的迁移率。
（3） 55℃退火 50 秒； （4） 72℃延伸 10 秒；
（5）重复步骤②-④30 次；
（6） 72℃彻底延伸 10 分钟。
琼脂糖凝胶电泳图
3 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 结果。
实验七 胶回收法纯化 DNA
实验目的
本实验利用胶回收纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中将目的 DNA 片段进行抽提纯 化，从中掌握切胶技术以及回收目的 DNA 片段并纯化的方法。
实验步骤：
1 将配好的电泳缓冲液，倒入电泳槽。 2 将琼脂糖凝胶放入微波炉熔化。 3 熔化后的琼脂糖凝胶倒入插好梳子的模具中。 4 静置 1 小时左右，等琼脂糖凝胶凝固后垂直拔去梳子。 5 将琼脂糖凝胶放入电泳槽中。 6 点样,一般上样量为 10×Loading Buffer 05-1μl、DNA 样品（质粒）3μl 混 匀，点入凝胶孔内。 7 质粒电泳参数：电泳仪的电压 100V，电流 500mA，功率 250W。电泳时间 40 分 钟。 8 将琼脂糖凝胶取出，放入紫外与可见分析装置。 9 凝胶成像系统显像，拍照。
基本要求：了解分子生物学的实验操作原理，掌握有关实验仪器的使用方法。
实验内容：
实验一.细菌质粒 DNA 的提取及酶切实验
（8 学时）
基本要求:
通过学习碱变性抽提法对大肠杆菌中的质粒的抽提，掌握质粒 DNA 的小量
制备方法，了解碱裂解法制备质粒 DNA 的原理。进一步了解限制性
内切酶的特性及酶切反应过程，掌握 DNA 的酶切技术。
离蛋白质的基本步骤及实验结果的判定 难点:
聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验步骤及实验结果的判定
实验一 氯化钙法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验目的
掌握重组 DNA 质粒转化至大肠杆菌宿主的操作技术。
实验原理
带有外源 DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量 复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒 DNA,,该过程称之为转化过程。 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂法）的处理后，细胞 膜的通透性发生变化，能容许外源 DNA 的载体分子通过。