第四章沉淀法

（ 3 ）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋
盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两 种情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋 白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和 电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。
1）盐析用盐的选择

盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
盐析用盐的选择
在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有 一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作 用较强，半径大的低价离子作用较弱 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 阴离子的影响大于阳离子
盐析的影响因素：3）蛋白质浓度
沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始 浓度有关。 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高， 会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。 在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀 作用比较少，但回收率会降低。 因此需要在两者之间进行适当选择。 分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加 一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。 一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL～30mg/mL。
盐析注意事项
硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有 敏感作用，使用前用H2S处理 高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使 用前也需要用氨水调节至所需PH。 硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意 盐析后一般放臵半小时至一小时，待沉淀完全后才过 滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种 情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心 速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较 低浓度硫酸铵溶液。
1. 什么是沉淀法？ 2. 沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？
3. 常用的沉淀方法包括哪些？
4. 何谓盐析？其原理是什么？ 6. 有机溶剂沉淀法的原理是什么？ 7. 影响有机溶剂沉析的主要因素有哪些？ 8. 等电点沉析的工作原理是什么？
5. 常用的盐是什么，影响盐析的主要因素有哪些？
概述
沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低 而形成无定形固体沉淀的过程。 沉淀法的目的： 通过沉淀达到浓缩的目的； 沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需 成分，初步纯化 ； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一 步处理。 沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目 前仍广泛应用在工业上和实验室中。
pH值
lgS β
8 OA-卵清蛋白 COHb-碳氧血红蛋白 OA ７ ６ ５ ４ ３ COHb 3 4 5 6 7 ８ PH 以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵 沉淀OA时，β随 pH的变化
两种蛋白质的相对溶解 度会随pH而变化很大；
β随pH 变化 （1）对数关系 （2） 等电点附近有极小值
盐析影响因素：2）温度的影响
盐析用盐的选择
盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠 硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉 ； （2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；
（3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，
（4） 不易引起蛋白质变性。
缺点： n（1）水解变酸； n（2）高pH 释氨，腐蚀； n（3）残留产品有影响。
等电点沉淀法
在低的离子强度下，调 pH至等电点，使蛋白质 所带净电荷为零，降低 了静电斥力，而疏水力 能使分子间相互吸引， 形成沉淀的操作称为等 电点沉淀 不同的两性电解质具有 不同的等电点，以此为 基础可进行分离。 生产胰岛素时，在粗提 液中先调PH8.0去除碱性 蛋白质，再调PH3.0去除 酸性蛋白质。
生物分离过程的一般流程
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 细胞破碎 碎片分离 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离(沉淀/超过滤/萃取)
纯化(层析、离子交换、吸附)
脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤) 精制(结晶、干燥)
复性
通过本章学习应掌握以下内容
性不强
沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1） 盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8）选择性沉淀法。
4.1 蛋白质的溶解特性
n
n
n
n
蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基 酸组成。 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向 内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性 氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨 基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外 表面。 因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷 电区、亲水区和疏水区构成。
对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫
酸铵饱和度为 58-65％之间沉淀出来； 但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始 沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。
盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸
概述
沉淀法的原理： 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的， 这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响 这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液 的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度， 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分 离的目的。 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶 液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解 度产生明显的改变。
在低离子强度或纯水中，蛋白
质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。 但在高浓度下，蛋白质、酶和 多肽类物质的溶解度随温度上 升而下降。 在一般情况下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在0-4℃进行。 β随温度升高减小，热促失水 膜 Ks不随温度而变
Cohn经验式
蛋白质溶解度与盐浓度的关系
㏒ S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率
β和Ks的物理意义
β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的 假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关， 与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率； 从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质 与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸 铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化 不会超过1倍。
pH=pI
等电点沉淀法
1.0
未沉淀Biblioteka Baidu白质的分率
0.8 0.6 0.4 0.2 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 对大豆蛋白质 溶解度的影响
图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。
盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（ 2 ）破坏水化膜，暴露出憎水区域， 由于憎水
区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。 白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力 降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集 而沉淀。

总蛋白
目标蛋白质
40
60
80
100
硫酸铵盐析过程 最适饱和度是30%，55%
盐析的影响因素：1）pH值
一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，
净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解 度最小。 为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的 等电点处。 注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓 度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整 溶液PH值，以达到最好的盐析效果。
沉淀完全后,让初生成的沉淀与母液一起放置一段时间,这个过程 称为“陈化”。
概述
沉淀法不仅用于实验室中，因其不需专门设备， 且易于放大，也广泛用于生产的制备过程， 是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶 时最常用的方法。
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择
盐析法特点：
1. 2.
3.
4.
成本低，不需要特别昂贵的设备。 操作简单、安全。 不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得 到保持生物活性的纯化蛋白质。 分离效果不理想，通常只是作为初步的分离 纯化，还需要结合其它的纯化方法。
4.３等电点沉淀法
isoelectric point precipitation
蛋白质的溶解特性
n
n
n
蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及 分子周围溶液性质所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所 以其大部分是亲水的，但其内部大部分 是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上 类似的大分子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，
n
虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白 质的溶解度，但它不能体现低盐浓度 （盐溶状态）下蛋白质的溶解度。
分段盐析(fractional salting out)
由于不同的蛋白质溶解度 不同，沉淀时所需的离子 上 强度也不相同， 清 如果需要先除去些杂蛋白， 液 然后在较高的饱和度下， 蛋 沉淀目标蛋白质，则可采 白 用分段盐析 浓 改变盐的浓度，可将混合 度 液中的蛋白质分批盐析分 开。 如半饱和硫酸铵可沉淀血 浆球蛋白，饱和硫酸铵则 0 20 可沉淀包括血浆清蛋白。
概述
n
n
沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析 物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透 析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
概述
沉淀法操作步骤 ： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收 率和沉淀物的形状都有很大影响。
n
2）盐浓度对盐析效果的影响
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越
低。 在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离 子强度顺次进行。 每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心 收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度， 使另一种蛋白质组分盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐 的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易 沉淀。
盐析
概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等 生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉 淀的过程。 盐析是可逆的，而变性是不可逆的
早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离 蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分 级中使用，得到了比较满意的结果。
盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量
缓冲液 在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应 该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶 解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。 盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放臵一段时间。 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。 盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢， 一般可用超滤
保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白 质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。 （存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电 的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自 身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反 离子的电荷构成双电层。
4.２盐析
Salt induced precipitation