制备型高效液相色谱的实验方法
生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法-有机化学论文-化学论文
生物碱的高效液相色谱分离分析和制备方法-有机化学论文-化学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：生物碱是天然产物中药用活性较好的一类化合物, 在分离科学与技术领域, 生物碱的分离一直是一个研究热点和难点问题。
近年来, 随着高效液相色谱填料和分离方法的发展, 生物碱的分离分析和纯化制备有了长足的进步。
该文主要针对碱性化合物的峰形拖尾问题, 综述了高效液相色谱理论的发展和色谱分离技术的进步, 以及近年来新型色谱填料和分离方法在生物碱分离分析和纯化制备中的应用, 并对其前景进行了展望。
关键词：生物碱; 拖尾; 制备色谱; 正交分离;Abstract：Alkaloids are a class of natural compounds with good pharmacological properties.In the field of separation science and technology, alkaloid separation has always been a hot and difficultproblem.In recent years, with the development of high performance liquid chromatography (HPLC) materials and separation methods, great progresses in alkaloid analysis and preparation have been achieved.In this article, the theoretical development and technological advances with respect to peak tailing problems of basic compounds are summarized, and the applications of HPLC in natural alkaloid analysis and preparation are discussed.The further development of HPLC separation on alkaloids is also looked forward.Keyword：alkaloids; peak tailing; preparative HPLC; orthogonal separation;生物碱是天然产物中药用活性和成药性较好的一类化合物, 据统计, 美国FDA批准的1 000多种小分子药物中, 碱性药物的比例超过60%[1]。
制备型高效液相色谱的实验方法
制备型高效液相色谱的实验方法陈明杰;危凤【摘要】Preparative high performance liquid chromatography has been widely applied in medicine, fine chemical and food, particu- larly applicable to separate high added value and high purity products. Tbis paper introduced the experiment teaching of preparative high performance liquid chromatography in separation of tocopherol, explored how to set up teaching content, and the ways of improving students ＂abilities to analyze and solve problems. The stvdents＇application abilities were strengthened.%制备型高效液相色谱已广泛应用于医药、精细化工、食品等行业,特别适用于分离高附加值、高纯度的产品。
通过制备型高效液相色谱分离生育酚各组分的教学实践,探讨了制备型高效液相色谱实验教学内容的设置,以及通过实验教学提高学生独立分析和解决问题能力的方法,强化了学生的应用能力。
【期刊名称】《实验科学与技术》【年(卷),期】2012(010)004【总页数】3页(P23-25)【关键词】制备型高效液相色谱;实验教学;生育酚;方法【作者】陈明杰;危凤【作者单位】浙江大学宁波理工学院生物与化学工程分院,浙江宁波315100;浙江大学宁波理工学院生物与化学工程分院,浙江宁波315100【正文语种】中文【中图分类】O658.11制备型高效液相色谱并非分析色谱的简单放大，两者有许多不同。
高效液相色谱法
高效液相色谱法高效液相色谱法(《中国药典》2010年版二部附录V D)系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带人柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局"液相色谱仪检定规程"定期检定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等〉也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm= lOA)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10µm之间。
粒径更小(约2µm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40°C，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60°C。
流动相的pH值应控制在2～8之间。
当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相实验报告
篇一：高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告一、实验目的1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过hplc分离测定来对目标化合物的分析鉴定。
二、实验原理液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。
当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。
液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。
高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。
80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。
三、高效液相色谱的分类吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法四、高效液相色谱仪的基本构造高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。
1 输液系统：包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。
贮液装置用于存贮足够量、符合hplc要求的流动相。
高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。
2 进样系统：将待测的样品引入到色谱柱的装置。
液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。
进样系统包括取样、进样两项功能。
3 分离柱：色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。
商品化的hplc微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。
实用高效液相色谱法的建立
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
高效液相色谱的使用方法
高效液相色谱的使用方法高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种用于分离、分析和测定混合物中组分的技术。
以下是高效液相色谱的使用方法：1. 样品制备：根据需要，样品可以通过溶解、浸提、纯化等方法进行前处理。
确保样品是均匀的，并且符合HPLC分析要求。
2. 选择合适的色谱柱：根据分析目标，选择合适的色谱柱，包括固定相（C18、C8、氨基、芳基等）和柱型（反相、离子交换、排除等）。
色谱柱质量对分离和分析结果至关重要。
3. 准备移动相：根据色谱柱要求和分析目标，选择合适的移动相。
移动相通常由溶剂和缓冲液组成，可以通过改变溶剂的组成和比例来调节色谱条件。
4. 设定色谱条件：根据需要，设定合适的色谱条件，包括流动相速度、柱温、检测波长等。
这些条件将直接影响分离的效果和分析的准确性。
5. 校准仪器：在开始分析之前，校准色谱仪和检测器，确保其准确性和稳定性。
校准通常包括检测器灵敏度、波长、流速等参数。
6. 注样和运行：将样品注入色谱柱，启动色谱仪，使移动相通过柱子，分离出样品中的各组分。
根据需要，通过改变运行时间、流速等参数，调节分离和分析的效果。
7. 数据分析：通过检测器检测样品中各组分的吸光度或荧光强度，并记录数据。
可以使用特定的色谱软件对数据进行处理和解析，以获得准确的分析结果。
8. 数据解释：根据分析结果，对样品中的各组分进行定量或定性的解释。
可以使用标准品进行定量分析，或者与已知数据进行比对，以确认各组分的身份和浓度。
9. 清洗和维护：在完成分析后，及时清洗色谱柱和仪器，以保持其性能和寿命。
根据需要，使用适当的溶剂进行清洗，并使仪器处于良好的工作状态。
总之，高效液相色谱的使用方法包括样品制备、色谱柱选择、移动相准备、色谱条件设定、校准仪器、注样和运行、数据分析、数据解释以及清洗和维护等步骤。
熟练掌握这些方法能够有效地进行高效液相色谱的分离和分析。
制备液相色谱技术(LC-MS)
纯度（purity)、产量（throughput） 和收益（yield）（PTY）三者的关系
浓度过载和体积过载
浓度过载
决定于流动相中的溶解度；
位于吸附等温线的“制备”区 域； 产量由选择性决定； 固定相颗粒大小影响较低。
体积过载
决定于进样体积；
位于吸附等温线的“分析”区 域； 产量由柱子的直径决定； 固定相颗粒需要小一些。
基于质量（Mass-based）
根据馏分的质量作为指令参数，触发馏 分收集器。 特点： 馏分纯度高、且收益高； 馏分保留时间以及色谱峰峰形改变都不会 影响到馏分的纯度； 参数设置方便； 需配备MS检测器，设备费用投入较大。
Mass-based
当使用按质量进行馏分收集时，只有当 MSD 检测到色谱峰含有目标质量数，且该目 标质量数的强度超出特定的阈值时，馏分收 集才被触发。这就确保了在每次进样中只收 集含目标化合物的馏分。大部分情况下只有 一个馏分。
为了准确地触发馏分收集器的启动和停止， 必须测定后运行时间。后运行时间可以转换成 与流速无关的延迟体积。 后运行时间测定方法之一： 通过在流路内注射一种染料，当馏分收集 器针尖出现该染料时记录时间。 后运行时间＝t馏分收集器- t检测器
后运行时间测定方法之二：
在馏分收集器内装入一个检测器，该检 测器称为延迟传感器。将延迟校正物注入流 路，两个检测器都记录信号。两个检测器之 间的时间差就是后运行时间。
高效制备液相色谱技术
高效制备液相色谱的原理：
色谱分离原理无论是分析型色谱还是制备型色谱都是相同的， 那就是色谱理论。 但是在理论的遵循上，制备型有时需打折扣。 这是由于两种类型的色谱最终的目的是不同的。 分析型色谱：分离度高，灵敏度高，以含量测定为目的。 制备型色谱：要求纯度、产量和收益。
高效液相色谱分析法(仪器+组成+分离类型+流动相选择)
2、主 要 部 件
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：30MPa以上。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液体的流动相高速通过时，将产生 很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱 的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、 流量稳定可调、耐腐蚀等特性
(2)梯度淋洗装置
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
4. 空间排阻分离固定相
liquid-solid adsorption chromatography 固定相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝等，较
常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：利用溶质分子占据固定相表面吸 附活性中心能力的差异；适用于分离相对分子 质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合 物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
GC：H = A + B / u + C • u （填充柱）
A = 2λ • dp
A ∝ λ • dp
B = 2γ • Dm = 2γ • Dg B ∝ t R ，B ∝ Dg
Dg
∝
T η
或Dg
∝
T M
B = 2γ • Dm
Dm
∝
T η
柱温T ↓低，流动相η ↑大 ⇒B相忽略
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数
(4) 高效分离柱
完整的高效液相色谱方案
完整的高效液相色谱方案一、基本原理HPLC的基本原理是将混合物中的化合物通过不同的分配系数分离出来。
在HPLC系统中，样品经过样品制备后被注入到流动相中，然后经过色谱柱的分离，最终通过检测器进行检测。
色谱柱是HPLC系统中最重要的组成部分，其选择决定了分离效率和选择性。
检测器根据化合物的特性和检测方法进行选择，如紫外可见光谱检测、电化学检测等。
二、仪器和色谱柱的选择HPLC系统由进样器、泵、色谱柱、检测器和数据处理系统组成。
首先需要选择适合的HPLC仪器，包括进样器、泵和检测器等。
进样器的选择需要考虑样品的性质和体积，以及进样的方式和精度。
泵的选择需要考虑流速、稳定性和准确性等因素。
检测器的选择需要根据分析方法和检测要求进行选择。
典型的检测器包括紫外可见光谱检测器、荧光检测器和质谱检测器等。
色谱柱是HPLC系统中最重要的组成部分，其选择决定了分离效率和选择性。
色谱柱根据填料材料和填充方式进行选择。
常用的填料材料包括正相、反相、离子交换、大小分离等。
填充方式包括开放式填充柱和闭环填充柱等。
选择色谱柱需要考虑样品的性质、分离目标和分析方法等因素。
典型的色谱柱包括C18柱、硅胶柱、离子交换柱和分子筛柱等。
三、操作流程HPLC系统的操作流程包括样品制备、进样、分离、检测和数据处理等步骤。
首先需要对样品进行制备，包括溶解、过滤和稀释等步骤。
然后将样品注入到进样器中，通过泵将样品送入色谱柱进行分离，最终通过检测器进行检测。
数据处理包括数据采集、数据处理和结果分析等步骤。
操作人员需要掌握HPLC仪器的操作方法和常见故障处理方法，以确保分析的准确性和可靠性。
四、样品准备样品准备是HPLC分析过程中至关重要的一步，其质量直接影响分析结果的准确性和可靠性。
样品制备包括溶解、过滤、稀释和去离子等步骤。
溶解是将样品溶解于适当的溶剂中，以便于进样和分离。
过滤是通过滤膜将杂质和颗粒去除，以减少色谱柱堵塞和检测器干扰。
稀释是将浓缩样品稀释到适当的浓度，以便于分离和检测。
制备型高效液相色谱的实验方法
制备型高效液相色谱的实验方法
高效液相色谱法是一种以高效液相色谱仪（HPLC）作为检测仪器的分析技术。
它是一种常规分离技术，在化学、生物和其他领域中被广泛应用，有助于提高分离精度，增强检测灵敏度。
本文主要介绍高效液相色谱法的制备实验步骤。
1.准备仪器。
用于进行高效液相色谱分析所需的仪器包括：高效液相色谱仪（HPLC）、上样系统和样品管等。
在进行实验前，需要先检查仪器并完成校准。
2.准备样品。
根据实验要求从样品容器中取出适量的样品，然后按照标准浓度进行配置，实验者有必要采用准确的体积来取样。
3.设置实验条件。
对实验中所需的参数进行设置，包括柱型、柱温、检出器模式、流动相构成、流速等，并按需要定义实验的时间。
提前进行后台校准。
4.进行实验。
将样品配好的溶液输入HPLC，维持实验的参数，然后开始实验。
实验结束后，自动保存实验结果。
5.结果分析。
根据实验结果，对分析结果进行分析，计算实验所需的一些指标，分析实验结果。
以上就是高效液相色谱法的制备实验步骤，实验者在执行实验时应重视仪器仪表的使用与维护，以确保实验数据的准确性。
分析化学 高效液相色谱法
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
制备型高效液相色谱仪操作流程
制备型高效液相色谱仪操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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2. 将高效液相色谱仪放置在稳固的桌面上。
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第 ４期
实 验 科 学 与 技 术
Ｅｘｐ ｒｍｅ ｉｎ ｅ ａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏ ｏ ｙ ｅ ｉ ｎｔＳｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇ
ＶｏＩ ０ Ｎｏ ４ ．１ ． Ａｕ ． ｇ ２０１ ２
２１ ０ ２年 ８月
制 备 型 高效 液 相 色 谱 的 实 验 方 法
Ａｂ ｔ ａ ｔ ｒ ｐ ｒ ｔ ｅ ｈｇ ｅｆ ｒ ｎ ｅ ｌ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｈ ｓ ｂ ｅ ｉ ｅｙ ａ ｐ ｉｄ ｉ ｄ ｃｎ ， ｆ ｅ ｃ ｅ ｃ ｌａ ｄ ｆｏ ｓ ｒ ｃ ：Ｐ ｅ ａａ ｉ ｉｈ ｐ ｒ ｍａ ｃ ｑ ｉ ｈ ｏ ｔｇａ ｈ ａ ｅ ｎ ｗ ｄ ｌ ｐ ｌ ｎ ｍｅ ｉｉ ｅ ｉ ｈ ｍｉａ ｎ ｄ，ｐ ｒｉｕ ｖ ｏ ｉ ｅ ｎ ｏ ａｔ － ｅ ｌ ｌ ｐ ｌ ａ ｌ ｅ ａ ａｅ ｈ ｇ ｄ ｅ ａｕ ｄ ｈｇ ｕ ｔ ｒｄ ｃ ｓ Ｔ ｉ ｐ ｐ ｒ ｎｒ ｄ ｃ ｄ ｔｅ ｅ ｐ ｒ ｎ ａ ｈ ｎ ｆ ｒ ｐ ｒ ｔ ｅ ｈ ｇ ｒ ａ ｙ ａ ｐ ｉ ｂ ｅｔ ｓ ｐ ｒ ｔ ｉ ｈ ａ ｄ ｄ ｖ ｌ ｅａ Ｊｈ ｐ ｒ ｙｐ ｏ ｕ ｔ． ｈ ｓ ａ ｅ ｔ ｕ ｅ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｅ ｃ ｉ ｇ ｏ ｅ ａ ａｉ ｉ ｈ ｃ ｏ ｎ ｉ ｉ ｏ ｈ ｉ ｔ ｐ ｖ ｐ ｒ ｒ ａ ｃ ｉｕ ｄ ｃ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ｙ ｉ ｅ ａ ａｉｎ ｏ ｏ ｏ ｈ ｒ ｌ ｘ ｌ ｒ ｄ ｈ ｗ ｔ ｅ ｐ ｔａ ｈｎ ｏ ｔ ｎ ， ａ ｄ ｔ ｅ ｗａ ｓ ｏ ｍｐ ｏ ｉｇ ｅｏ ｆ ｍ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｎ ｓ ｐ ｒ ｔ ｆｔｃ ｐ ｅ ｏ ，ｅ ｐ ｏ ｅ ｏ ｏ ｓ ｔｕ ｅ ｃ ｉ ｇ ｃ ｎ ｅ ｔ ｎ ｈ ｙ ｆ ｉ ｒｖ ｎ ｑ ｏ ｓ ｄ ｎ ｓ ｂ ｌ ｉｓ ｔ ａｙ ｅ ａ ｄ ｓ ｌ ｅ ｐ ｏ ｌ ｍｓ Ｔｈ ｔ ｄ ｎ ｓ ａ ｐ ｉａｉ ｎ ａ ｉ ｔ ｓ ｗ ｒ ｔｅ ｇｈ ｎ ｄ ｔ ｅ ｔ ａ ｉ ｔ ｏ ａ ｌ ｚ ｏ ｖ ｒ ｂｅ ． ｅ ｓｔ ｅ ｔ ｐ ｌ ｔ ｌ ｉ ｅ ｅ ｓｒ ｎ ｔｅ ｅ ． ｕ ｉｅ ｎ ｎ ， ｃ ｏ ｂ ｉｅ Ｋｅ ｒ ｓ ｐ ｅ ａ ａｉ ｅ ｈｇ ｅ ｏ ａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ ｏ ａ ｈ ； ｅ ｐ ｒ ｎ ；ｔ ｃ ｐ ｅ ｏ ；ｍｅｈ ｄ ｙ ｗｏ ｄ ： ｒ ｐ ｒ ｔ ｉｈ ｐ ｒ ｒ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ｐ ｙ ｖ ｆｍ ｑ ｒ ｘ ｅ ｍｅ ｔ ｏ ｏ ｈ ｒ ｌ ｉ ｔｏ
析。 ．
目前 很 多高 校 都 开 设 了 高 效 液 相 色 谱 实 验 教 学 ，也 有相关 实验 教学 的研 究 一ｊ ，但关 于 制备 型 高效液 相色谱 实 验教学 的研 究未 见报 道 。
（） ２ 色谱 条件 ：色谱 柱 为 Ｏ Ｓ分 析柱 （５ Ｄ １０ｍｍ
× ． ｍ，５ ｍ） ４ ６ｍ ，填 料 为 Ｈ ｐ ｒ ｌ ｙ ｅｓ ，流 动相 为 甲 ｉ
制 备色谱 和分 析色谱 的最大不 同是 制备 色谱 主
要 考察 目标产 物 的纯度 、产 量 、生 产周 期 、生产 成
２ ３ 实验 步骤 ．
２ ３ １ 配 置 溶 液 ． ．
本 等 。我们通 过制 备色谱 实验 使学 生深 刻 了解制备
（） １ 进料 原料的配置 。准确称 取 １ ０ｇ生育酚原料 ，
陈 明 杰 ，危
（ 江大学 浙
凤
宁波 ３ ５０ ） １１０
宁 波 理 Ｔ 学 院生 物 与化 学 工 程 分 院 ，浙 江
摘 要 ：制备 型高效液相 色谱 已广泛应用于 医药、精 ￣４ －、食 品等行 业，特 别适 用 于分 离高 附加 值、高纯度 的产品 。通过 ｇ． ｒ － 制备型高效液相 色谱 分 离生育酚各组分的教 学 实践 ，探 讨 了制备型高效液相 色谱 实验教 学 内容的设置 ，以及 通过 实验教 学 提 高 学 生 独 立 分 析 和 解 决 问题 能 力 的 方 法 ，强 化 了学 生 的 应 用 能 力 。 关 键 词 ：制 备 型 高 效 液 相 色谱 ； 实验教 学 ；生 育 酚 ；方 法
ｇ
０
Ｏ
２ 制备型高效液相色谱分离生育酚各组分
图 １ 生育酚各组分 的流分切 割与循环进样
２ １ 实验 目的 ．
了解 制备 型高 效液相 色谱 分离 的基本 原理 ；区 分 制备 型高效 液相 色谱 和分 析型高 效液 相色谱 的共
同点和不 同点 。
２ ２ 仪器 与试 剂 ．
（ ） １
（ ） 分 切 割 与循 环 进样 ：为 提 高制 备 色谱 的 ２流
１３ 原 料 生育酚 中各 组分 含量测 定 ．
分析液相色谱仪（ ５ １ ，Ｋ ５ １ Ｋ一 ０ 泵 ２０ 紫外检测
收 稿 日期 ：２ １ — ９— ０ ０ １ ０ ３ ：修 改 日期 ：２ １ ０ ０２— ２—２ ０ 基金 项 目 ：宁 波 市 生 物 医 药 应 用 型 专 业 人 才 培 养 基 地 研 究
化 妆 品等 行 业 Ｊ ，是 一 种 极 具 市 场 前 景 的热 门
产品。
０ １ ６０ ｇ ． ４ 、０ １ ６ ８ ｇ ． １ ． ０ 、０ １ １５ ｇ ． ７ 、０ ２ ９８ ｇ定
容 于 １ ０ ｍＬ容 量 瓶 ，对 标 准 溶 液 进 行 ＨＰ Ｃ 分 Ｌ
制 备 型 高效 液 相 色 谱 并 非 分 析 色 谱 的简 单 放 大 ，两 者有 许 多不 同 。分 析色谱 需要 全 面地反 映样
器 ，手 动 进 样 ，进 样 体 积 ２ Ｉ ，购 自 德 国 ０ ｘ Ｌ）
ＫＡ Ｅ Ｎ Ｕ Ｒ公 司 ；分 析型 色 谱柱 （５ ｍ × ． １０ｍ ４ ６ｍｍ，
（ ） 作条 件 ：色谱 柱为 Ｏ Ｓ分 析柱 （ ０ ｍ １操 Ｄ １０ ｍ ×１ ｍ，２ ｍ） ０ｍ ０仙 ，填 料 为 Ｈ ｐ ｒ ｌ ｙｅｓ ，流动 相 为 甲 ｉ 醇 ，流速 ２ｍ Ｌ・ ｉ ～，进样 体 积 为 １ Ｌ ｍｎ ｍ ，检测 波
长 ２ ２ｎ ９ ｍ。
醇 ，流 速 ０ ８ｍＬ・ ｎ ． ｍｉ～，检 测波 长 ２ ２ ｎ ９ ｍ。
半制 备 液相色 谱仪 （ Ｋ一５ １ ，Ｋ ５ １紫 外检 ０泵 ２０ 测 器 ，手 动 进 样 ，进 样 体 积 １ｍＬ） ，购 自德 国 ＫＡ Ｅ Ｎ Ｕ Ｒ公 司 ；半 制 备 型 色 谱 柱 （ ０ ｍ ×１ １０ ｍ ０ ｍ ｍ，２ ｍ） 自大 连伊利 特 ；Ｓ ３０ 声波 清洗 ０ 购 Ｂ ２０超
２ ３ ３ 产品 分析 ．．
（） １ 安装 分析 型色 谱柱 ，按仪 器 操作 说 明依 次 打开色 谱各单 元 。 （）ｍ Ｄ １０ｍ
× ． ｍ，５ ｍ） ４６ｍ ，填料 为 Ｈ ｐｒｉ ｙ ｅｓ ，流 动 相 为 甲 ｌ
ｏ ｔｇ ａ ｈ Ｐｅ ｆ ｒ ａ ｃ ｑ ｉ ｒ ｏ ｍ ｎ ｅ Ｌｉ ｕ ｄ Ｃｈｒ ｍ ａ ｏ ｒ ｐ ｙ
．
Ｃ Ｅ ｎ －ｅ Ｈ Ｎ Ｍｉｇｊ ，ＷＥ ｅ ｇ ｉ Ｉ ｎ Ｆ
（ ｉｇ ｏＩ ｓ ｔｔ ｏ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｈ ｊ ｎ ｎｖｒｉ ，Ｎ ｎ ｂ ０，Ｃ ｉａ Ｎ ｎ ｂ ｎ ｔｕｅ ｆ ｃ ｎ ｌ ，Ｚ ｅｉ ｇ Ｕ ｉ ｓ ｙ ｉ Ｔ ｇ ａ ｅ ｔ ｉｇ ｏ３ ５ ０ １１ ｈｎ ）
项 目（ｄ７ ２ １ Ｊ０ ０Ｏ ）。
（ ） １ ０ ｇ・Ｌ 的 生 育 酚 原 料 进 料 液 稀 １ 将 ０
释 至 ５ Ｌ ，使 各 组 分 的 浓 度 在 标 准 曲线 的 ０ｇ・ ～ 测 定 范 围 内 测 定 ９ 生 育 酚 原 料 中 各 组 分 的 含 ７
量
作 者 简 介 ：陈 明 杰 （９ ２一） 男 ，本 科 ， 实验 师 ，主 要 从 １８ ，
机 购 自宁波新 芝生 物科技 公 司 。
（ ） 别 进样 ２ ，得 到各 组 分 的 保 留时 间 ３分 ０
和峰 面积 。
２ ４ 实 验 结 果 ．
甲醇 购 自国药 集 团 ；原 料 是 ９ 的 混 合 生 育 ７
酚 ，购 自九 三油脂 公 司。
２ ４ １ 制备 色谱 生产效 率的 考察 ． ．
用甲醇定容于 １０ｍ ０ Ｌ容量瓶中 ，浓度为 １０ｇ－ ～。 ０ Ｌ （ ） 动相 的配 置 。为 减少 流 动相 后 续 回 收 的 ２流 难度 ，本 实验 直接 以 甲醇 为流 动相 。
２ ３ ２ 生育酚各 组 分流分 切割 与循 环进样 ． ．
色谱的特点， 使理论知识和生产实际相结合， 培养
数 量增 加 ；使 女 子 雌 性 激 素 浓 度 增 高 ，提 高 生 育
能 力 ，预 防流 产 。它 广泛 用 于 医药 保 健 品 、食 品 、
（ １）分 别 称 取 ９ 生 育 总 酚 ０ ０ ９ ０ ｇ ７ ． ０ 、
０． ２ ０ ｇ、 ０． ０２ ０３８ ｇ、 ０． ０ ０５１ ｇ、 ０． ０ ｇ、 ０ ０８ ０
品组成 的信 息 ，而不 必收 集特定 组 分 ；而制备 色谱
主要 考察 目标产 物 的纯度 、产 量 、生产周 期 、生产 成本 等 ¨ 。 生 育酚 又 称 维 生 素 Ｅ，是 最 主 要 的 抗 氧 化 剂 之一 。它 能促 进 性 激 素 分 泌 ，使 男 子 精 子 活 力 和
１ 采用 外 标 法测 定 生 育 酚各 组分 的含 量
１ １ 仪 器与试 剂 ．
醇 ，流 速 ０ ８ｍ ｍｉ ～，检测 波长 ２ ２ ｎ ． Ｌ・ ｎ ９ ｍ。
（） ３ 实验结 果 ：以生育 酚 总 酚 的峰 面 积 为横 坐
标 ，浓 度 Ｃ ｇ・ ） （ Ｌ 为纵 坐标 ，绘制 准 曲线 ，进 行 回归 分析 ，结 果如 表 １ 示 。 所
中图 分 类 号 ：０ ５ ． ６ ８ １＋１ 文 献 标 志 码 ：Ａ ｄｉ ０ ３ ６ ／． ｓ．６ ２— ５ ０ ２ １ ．４ ０９ ｏ：１．９ ９ ｊｉ ｎ １７ ４ ５ ．０ ２０ ．０ ｓ