生物化学实验原理与技术
《生物化学》实验讲义
实验一蛋白质及氨基酸的颜色反应一、目的意义1、学习几种鉴定氨基酸与蛋白质的一般方法及其原理。
2、学习和了解一些鉴定蛋白质的特殊颜色反应及其原理。
二、实验原理1、双缩脲反应当尿素加热到180℃左右时，2分子尿素发生缩合放出1分子氨而形成双缩脲.双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合生成复杂的紫红色化合物,这一呈色反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有多个与双缩脲相似的键，因此也具有双缩脲的颜色反应.借此可以鉴定蛋白质的存在或测定其含量。
应当指出，双缩脲反应并非蛋白质的特异颜色反应，因为凡含有肽键的物质并不都是蛋白质.2、茚三酮反应蛋白质与茚三酮共热,产生蓝紫色化合物，此反应为一切蛋白质及α-氨基酸（除脯氨酸和羟脯氨酸）所共有。
含有氨基酸的其他化合物也呈此反应.该反应十分灵敏，1:1500000浓度的氨基酸水溶液就能呈现反应。
因此，此反应广泛用于氨基酸的定量测定.3、黄色反应含有苯环侧链的（特别是含酪氨酸）蛋白质溶液与硝酸共热时，呈黄色（硝基化合物)，再加碱则变为橙黄色，此反应也称为黄蛋白反应。
OH+HNO3HO NO2+H2OHO NO2+O NOH三、仪器与试剂1、试剂(1) 蛋白质溶液：取10mL鸡蛋清,用蒸馏水稀释至100mL,搅拌均匀后用纱布过滤得上清液。
（2) 0。
3％色氨酸溶液、0。
3%酪氨酸溶液、0。
3％脯氨酸溶液、0。
5％甘氨酸溶液、0.5%苯酚溶液。
(3） 0.1％茚三酮－乙醇溶液:称取0。
1g茚三酮，溶于100mL 95％乙醇。
(4） 10%NaOH溶液、1％硫酸铜溶液、尿素、浓硝酸.2、仪器：试管及试管夹、酒精灯。
四、操作方法1、双缩脲反应(1) 取一支干燥试管，加入少量尿素,用微火加热使之熔化,待熔化的尿素开始变硬时停止加热。
此时，尿素已缩合为双缩脲并放出氨气（可由气味辨别）.待试管冷却，加入约1mL10％NaOH溶液，振荡使其溶解，再加入1滴1%硫酸铜溶液。
混匀后观察出现的粉红色. (2）另取1支试管，加入1mL蛋白质溶液，再加入2mL 10%NaOH溶液摇匀，然后再加入2滴1%的硫酸铜溶液。
生物化学实验原理和方法
生物化学实验原理和方法
生物化学实验是研究生物体内化学反应的实验方法，主要用于研究生物体内分子结构、代谢途径、蛋白质结构和功能等方面的问题。
生物化学实验的基本原理是利用生物体内的生物分子（如蛋白质、核酸、酶等）进行化学反应或与其他物质相互作用，从而检测、分离或定量这些分子。
生物化学实验主要包括以下几个方面的原则和方法：
1. 分离与纯化：将某一特定生物分子从其他组分中分离出来，获得纯净的样品。
常用方法包括离心、电泳、柱层析、过滤等。
2. 分析与测定：对生物分子的含量、结构和性质进行定量或定性的研究。
常用方法包括分光光度法、荧光法、比色法、拉曼光谱等。
3. 酶反应：酶是生物体内催化生物化学反应的一类蛋白质，其活性与底物浓度、温度、pH值等因素有关。
通过测定底物转化率来研究酶的活性。
常见的酶反应方法有酶解反应、酶促进反应等。
4. 蛋白质分析：蛋白质是生物体内最为重要的分子之一，可以通过电泳、质谱、Western blot等方法进行分析，从而了解蛋白质的结构、含量和功能。
5. 核酸分析：核酸是生物体内遗传信息的主要载体，可以通过PCR、凝胶电泳、
Southern blot等方法进行分析，用于检测基因的突变、限制性片段长度多态性等。
以上是一些常用的生物化学实验原理和方法，实际的生物化学实验会根据具体的研究目的和问题而选择适合的方法和技术。
00 生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-比色分析技术
比色分析技术分光光度法是利用单色器（主要是棱镜）获得单色光来测定物质对光吸收能力的方法。
物质对不同波长的光波具有选择吸收的特性，分光光度法就是基于物质的这种特性而建立起来的分析方法，它是光谱分析技术中最基本和最常用的方法，因其具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好等特点而被广泛应用。
一、比色分析的基本原理比色分析技术是利用物质对光的吸收作用来对物质进行定性或定量分析的技术。
分光光度法是光谱分析技术中最常用的一种，应用最多的是紫外 - 可见光分光光度法。
（一）吸光度与透光度当一束光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光被吸收，另有一部分光透过溶液。
设入射光强度为I 0 ，透射光强度为I ，I 和I 0 的比值称为透光度（ transmittance ，T ），即T ＝，其数值小于 1 。
T 与 100 的乘积称为百分透光度，以 %T 表示。
透光度的负对数称为吸光度 (absorbance ， A) 。
其表达式为：A ＝－LgT ＝－Lg ＝Lg（二） Lambert-Beer 定律Lambert-Beer 定律指出当一束单色的辐射能通过介质或溶液后，有一部分被吸收，其辐射能的吸收与溶液中吸收物质的浓度和溶液厚度的乘积成正比。
Lambert-Beer 定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。
Lambert-Beer 定律是描述溶液吸光度同溶液浓度和溶液液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
其表达式为：A ＝KLC式中，A ——吸光度；K ——吸光系数；L ——溶液厚度，称为光径；C ——溶液浓度。
根据 Lambert-Beer 定律，当液层厚度单位为 cm ，浓度单位为 mol/L 时，吸光系数K 称为摩尔吸光系数（ε）。
ε的意义是：当液层厚度为 l cm ，物质浓度为 l mol/L 时，在特定波长下的吸光度值。
ε是物质的特征性常数。
在一定条件（入射光波长、温度等）下，特定物质的ε不变，这是分光光度法对物质进行定性的基础。
生物化学实验层析技术和原理
生物化学实验层析技术和原理一、引言层析技术是一种常用的分离和纯化生物化学物质的方法。
它基于样品中不同成分在固定相和流动相之间的差异，通过分离和收集这些成分来实现纯化的目的。
层析技术包括多种类型，其中层析柱技术是最常用的一种。
本文将重点介绍层析柱技术的原理和应用。
二、层析柱技术的原理层析柱技术基于样品中成分在固定相和流动相之间的差异，通过固定相的选择和流动相的控制来实现成分的分离。
其原理主要包括以下几个方面：1. 固定相的选择固定相是层析柱中的填料，根据所需分离的物质特性选择不同类型的固定相。
常见的固定相包括硅胶、葡聚糖、高效液相色谱柱等。
不同的固定相具有不同的亲疏水性、分子尺寸和表面性质，可以选择合适的固定相来实现目标物质的分离。
2. 流动相的选择流动相是层析柱中用于洗脱样品成分的溶液。
根据目标物质的性质和固定相的特性选择合适的流动相。
常见的流动相包括纯水、有机溶剂和缓冲液等。
流动相的选择要考虑到目标物质的溶解性、稳定性和分离度等因素。
3. 样品的处理在进行层析柱实验前，需要对样品进行适当的处理。
例如，可以通过离心、过滤或稀释等方式去除杂质、浓缩样品或调整样品的浓度。
样品处理的目的是为了提高样品的纯度和分离效果。
4. 层析柱的操作层析柱的操作包括样品的进样、流动相的流动和目标物质的洗脱。
进样时，样品通过注射器或自动进样器加入到层析柱中。
流动相通过柱床时，样品成分会在固定相上发生吸附和解吸作用，从而实现分离。
目标物质的洗脱是通过改变流动相的性质或梯度浓度来实现的。
三、层析柱技术的应用层析柱技术在生物化学实验中具有广泛的应用，常见的应用领域包括：1. 蛋白质纯化层析柱技术可以根据蛋白质的特性进行选择性分离和纯化。
例如，通过离子交换柱可以根据蛋白质的电荷特性进行分离；通过亲和层析柱可以根据蛋白质与配体的特异结合进行分离。
2. 核酸纯化层析柱技术可以通过选择性吸附和洗脱来实现核酸的分离和纯化。
例如，通过亲和层析柱可以根据核酸与配体的特异结合进行分离；通过凝胶过滤柱可以根据核酸的大小进行分离。
生物化学实验层析技术和原理
生物化学实验层析技术和原理层析技术是一种常用的分离和纯化生物化学物质的方法，它基于不同化学物质在固定相和流动相之间的差异，通过分离、迁移和重新结合来实现分离和纯化的目的。
层析技术广泛应用于生物化学、药物研发、环境监测等领域。
一、层析技术的分类根据不同的分离原理和操作方式，层析技术可以分为多种类型，常见的有：1. 柱层析：将样品溶液通过填充在柱中的固定相，利用样品在固定相和流动相之间的相互作用进行分离。
2. 薄层层析：将样品溶液涂布在薄层层析板上，利用样品在固定相和流动相之间的分配系数进行分离。
3. 纸层析：将样品溶液滴在纸上，利用样品在纸和流动相之间的相互作用进行分离。
二、层析技术的原理层析技术的原理基于样品在固定相和流动相之间的相互作用差异。
这些相互作用可以是吸附、分配、离子交换、凝胶渗透等。
1. 吸附层析吸附层析是利用样品在固定相上的吸附作用进行分离的方法。
固定相通常是一种多孔性材料，如硅胶、活性炭等。
样品中的化合物会与固定相表面发生吸附作用，不同化合物的吸附能力不同，从而实现分离。
2. 分配层析分配层析是利用样品在固定相和流动相之间的分配系数进行分离的方法。
固定相可以是液相或固相，流动相可以是液相或气相。
样品中的化合物在固定相和流动相之间的分配系数不同，从而实现分离。
3. 离子交换层析离子交换层析是利用样品中离子与固定相上的离子交换作用进行分离的方法。
固定相通常是一种具有离子交换基团的树脂，如阴离子交换树脂、阳离子交换树脂等。
样品中的离子与固定相上的离子交换，不同离子的交换能力不同，从而实现分离。
4. 凝胶渗透层析凝胶渗透层析是利用样品中的大分子在凝胶固定相中的渗透作用进行分离的方法。
凝胶固定相通常是一种具有孔隙结构的材料，如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
样品中的大分子在凝胶固定相中的渗透速率不同，从而实现分离。
三、层析技术的步骤层析技术的基本步骤包括样品制备、填充柱或涂布固定相、样品加载、洗脱和收集。
生物化学实验原理与方法
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沉降系数的作用： 1、描述颗粒的大小 2、预计沉降时间 对已知S值的物质，可预计在离心管中的沉降所需时间。 3、 测定物质的分子量 根据Svedberg公式可计算出分子量。
M=RTS20,w/D20,w(1-Vρ)
R--气体常数，等于1.987卡/度.摩尔 T—热力学温度
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二、有机溶剂沉淀法
原理：有机溶剂对许多溶于水的小分子生化物质以及核酸、 多糖、蛋白质等生物大分子都能发生沉淀作用。有机溶剂 的沉淀作用主要是降低溶液的介电常数从而 增强分子之 间的相互作用，使其溶解度降低。对于具有表面水层的生 物大分子来说，有机溶剂可破坏溶质分子表面的水膜，使 这些大分子脱水而相互聚集析出。不同溶质要求不同浓度 的有机溶剂，因此可用有机溶剂进行分步沉淀。
化学处理 用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯仿、甲苯）或表面活性剂（SDS）处理细胞时，可以把
细胞壁、细胞膜的结构部分溶解，进而使细胞释放出各种酶类物质，并导致整个细胞 破碎。 生物酶降解 生物酶有降解细菌细胞壁的功能，在用此法处理细胞时，先是细胞壁降解，随之而来 的是因渗透压差引起的细胞膜破裂，最后导致细胞完全破碎。
３、ＰＨ对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，溶解度 越大；在净电荷为零时，溶解度最低。一般将ＰＨ值调到 蛋白质等电点附近，这样有利于盐析。
４、温度对盐析的影响：在低离子强度或水中在一定范围 内蛋白质的溶解度随着温度的升高而增加；但在高盐溶液 中，温度的升高有时反而下降。一般情况下在０~４℃操 作。
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第五节、制备型超速离心法
大学生物化学实验报告
一、实验名称：蛋白质分子量测定——凝胶层析法二、实验目的：1. 了解凝胶层析法的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用凝胶层析法测定蛋白质的分子量。
3. 培养实验操作技能和数据处理能力。
三、实验原理：凝胶层析法是一种利用凝胶作为固定相，通过分子大小不同的物质在凝胶孔径中的移动速度差异来实现分离的方法。
在凝胶层析中，大分子物质不能进入凝胶内部的孔径，而小分子物质可以进入孔径，从而在洗脱过程中，大分子物质先流出，小分子物质后流出。
通过测量不同分子量蛋白质的洗脱体积，可以计算出其分子量。
四、实验材料与试剂：1. 凝胶层析柱（直径1.5cm，长30cm）2. 凝胶（聚丙烯酰胺凝胶）3. 蛋白质样品（已知分子量）4. 标准样品（已知分子量）5. 洗脱液（Tris-HCl缓冲液）6. 显色剂（考马斯亮蓝G-250）7. 移液器8. 旋转混匀器9. 分光光度计五、实验步骤：1. 准备凝胶层析柱：将凝胶倒入层析柱中，用洗脱液充分浸泡凝胶，直至凝胶膨胀并固定在层析柱中。
2. 准备样品：将蛋白质样品和标准样品分别稀释至适当浓度。
3. 加样：将蛋白质样品和标准样品分别加入凝胶层析柱中，用洗脱液洗脱，收集不同洗脱体积的洗脱液。
4. 显色：将收集到的洗脱液加入考马斯亮蓝G-250显色剂，室温下显色10分钟。
5. 测量：用分光光度计测定显色液在595nm处的吸光度值。
6. 数据处理：以标准样品的分子量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
根据蛋白质样品的吸光度值，从标准曲线上查得蛋白质的分子量。
六、实验结果：（此处插入实验数据表格，包括标准样品和蛋白质样品的分子量、洗脱体积、吸光度值等）七、实验分析：通过凝胶层析法，成功分离了蛋白质样品，并测定了其分子量。
实验结果表明，蛋白质样品的分子量与标准样品的分子量相符，说明实验操作正确。
八、讨论与心得：1. 凝胶层析法是一种简单、有效的蛋白质分离方法，可用于测定蛋白质的分子量。
2. 在实验过程中，要注意凝胶层析柱的制备、样品的加入和洗脱液的收集等操作步骤，以保证实验结果的准确性。
生物化学实验内容
生物化学实验内容生物化学实验内容一、细胞的酶促反应实验实验原理：酶是生物体内起调节和催化作用的一类蛋白质，它能够催化某些基质（叫底物）的反应，促使底物转化成产物的过程。
本实验以酵母中的酶为例，研究酵母如何利用葡萄糖进行发酵反应，以产生二氧化碳气体。
实验步骤：1. 准备酵母发酵液：先在酵母粉中加入适量的葡萄糖，加入5%的酵母悬液，搅拌均匀，然后使用减压过滤器将液体过滤，并将过滤出的发酵液倒入操作管内。
2. 制备实验装置：将操作管与气体收集瓶通过U型玻璃管连接起来，用消毒酒精灯将管道消毒，然后将取样器放到气体收集瓶内。
3. 开始实验：将操作管倒置放在气体收集瓶内，然后用黄色指示移交管检测样品PH值。
等取样器内的气体达到稳定状态后，记录气体体积和温度，计算出气体的体积（记为V），并使用计算器计算气体里面的CO₂体积比例（%VCO₂=气体中CO₂体积/气体总体积）。
4. 重复实验：重复三次以上实验，计算平均值并分析实验数据。
实验结果：根据实验可得，当葡萄糖浓度越高时，发酵液中可产生的二氧化碳气体就会越多。
而当发酵液中的酵母数量增加时，发酵反应速率增快，产生的二氧化碳气体也会相应增多。
另外，当发酵温度过低或酸碱度过高，也会影响酵母的生长繁殖和发酵反应。
二、酶的催化实验实验原理：酶能够将底物转化成产物，同时不会自身发生变化，其催化作用也受到环境因素的影响。
本实验通过比较未加酶的底物和加入酶的底物的反应速率，来探究酶的催化作用。
实验步骤：1. 制备酶溶液：取适量的胰蛋白酶，加入适量的缓冲液，搅拌均匀，制成胰蛋白酶溶液。
2. 制备底物溶液：取适量的葡萄糖溶液，分成两份。
其中一份为未加酶的底物。
3. 加入酶溶液：将另一份葡萄糖溶液加入适量的酶溶液中，即为加入了酶的底物溶液。
4. 测定反应速率：分别加入两份底物溶液到不同的试管中，同时开始计时，观察反应产物生成的颜色变化，记录每个时间点的吸光度。
5. 分析实验结果：根据实验数据和曲线分析，可以得出在加入酶的情况下，底物反应速率明显比未加酶的底物快。
生物化学实验报告
生物化学实验报告一、实验目的本实验的目的是通过比较原淀粉、糖粉、滑石粉及无机盐等对酶水解作用的影响，了解和掌握酶的底物特异性、温度敏感性及pH敏感性。
二、实验原理酶是一类具有催化功能的特殊蛋白质，可以在生物体内加速对物质的转化过程。
酶的活性受到多种因素的影响，如底物特异性、温度、pH值等。
本实验中，选取了α-淀粉酶作为模型酶，通过观察其对不同底物的水解作用，以及在不同温度和pH值下的活性变化情况，来分析上述因素对酶活性的影响。
三、实验步骤1. 准备四个试管，分别加入原淀粉溶液、糖粉溶液、滑石粉溶液及无机盐溶液。
2. 在每个试管中加入适量的α-淀粉酶溶液，混匀后放置于恒温水浴中反应一段时间。
3. 分别取出各试管，加入碘液进行显色反应，观察溶液颜色的变化，并记录结果。
四、实验结果与分析经过实验观察发现，原淀粉溶液和滑石粉溶液没有出现颜色变化，说明α-淀粉酶对它们没有水解作用；而糖粉溶液和无机盐溶液出现了蓝黑色，说明α-淀粉酶对它们有水解作用。
这说明α-淀粉酶对底物的水解具有一定的特异性。
此外，实验还发现α-淀粉酶的活性受到温度和pH值的影响。
在不同温度下，α-淀粉酶的活性变化情况如下：当温度较低时，酶的活性较低，水解作用较慢；当温度逐渐升高时，酶的活性逐渐增强，水解作用加快；当温度超过一定范围后，酶的活性开始下降，甚至完全失活。
这表明酶的活性受到温度的限制，存在一个较适宜的工作温度范围。
同样地，在不同pH值下，α-淀粉酶的活性也有所变化。
实验结果显示，当pH值在酶的最适范围内时，酶的活性最高，水解作用最强；当pH值偏离最适范围时，酶的活性下降，水解作用减弱。
这说明酶的活性也受到环境的静电作用的影响，存在一个较适宜的pH值范围。
五、实验总结通过本次实验，我们进一步了解了酶的特性和具体影响因素。
酶的底物特异性以及温度和pH值对酶活性的影响是使用酶进行实验和应用的重要参考因素。
此外，本实验还展示了酶与底物之间的相互作用和调控机制，在理解酶的功能和应用方面具有重要意义。
00 生物化学实验--常用生物化学实验技术及原理-离心技术
离心技术一、离心技术的基本原理离心技术是实验室常采用的技术，主要是利用离心力将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同的各种物质成分的方法。
被分离液体中的可沉淀微粒，在重力和浮力相互作用下所受到的下沉力有如下的关系式：F ＝重力－浮力＝VPg －Vδg ＝Vg （p －δ）式中，F ——下沉力；V ——微粒体积；P ——微粒密度；δ——介质密度；g ——重力加速度。
当P ＞δ时，微粒下沉；P 与δ差值越大，微粒下沉速度越快。
因此，加大离心机转速可加快离心微粒的沉降速度。
二、制备性离心技术的基本原理制备离心技术是以分离、纯化、制备某一生物分子、亚细胞粒子、细胞器和细胞为目的的离心技术。
根据原理不同，制备性离心技术可分为差速离心技术和密度梯度离心技术两大类。
差速离心技术是指根据悬浮液中颗粒的不均一性，不同颗粒有着不同的沉降速度，通常颗粒大的沉降速度快。
为了将各不均一的颗粒组分分开，可以选用不同的离心速度，即可由低速到高速分阶段进行离心，或采用高速与低速交替反复离心，这样可使沉降速度不同的颗粒在不同的离心速度和不同的离心时间下分批沉降析出，同时得到所需要的成分。
密度梯度离心技术是指事先在离心管中放入不同密度的离心介质，离心管从上至下，介质密度由低到高，形成一个具有密度梯度的离心介质。
介质的最大密度需小于样品中最小颗粒的密度，这样就保证了样品中所有颗粒沉降速度大于零。
加样品于密度梯度离心介质上，在离心过程中，颗粒或向下沉降、或向上浮起，沿梯度移动，直至与它密度相等的位置形成区带。
处于等密度处的颗粒，由于溶于密度梯度介质中而没有重量，不再沉浮。
不同颗粒的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大分离效果越好。
区带的形状、位置均不受离心时间的影响。
三、离心机的分类（一）根据转速分类1 ．常速离心机指转速少于 5 000r/min 的离心机，主要用于一般液体中可沉淀颗粒的分离，或者制备一般的组织匀浆。
2 ．高速离心机指转速在 5 000 ～ 25 000r/min 之间的离心机，主要用于细胞器的分离和生物大分子的制备。
生物化学实验实训报告
一、实验目的1. 熟悉生物化学实验的基本操作流程。
2. 掌握常见生物化学实验方法及原理。
3. 培养严谨的科学态度和实验技能。
二、实验原理本实验主要涉及以下原理：1. 酸碱滴定法：利用酸碱指示剂的颜色变化来判断滴定终点，通过计算反应物的摩尔比来确定待测溶液的浓度。
2. 紫外-可见光谱法：通过测量待测物质在特定波长下的吸光度，根据比尔定律计算其浓度。
3. 酶活性测定：通过检测酶催化反应的速率来评估酶的活性。
三、实验器材与试剂1. 器材：酸式滴定管、碱式滴定管、锥形瓶、移液管、移液器、试管、紫外-可见分光光度计、恒温水浴锅、天平等。
2. 试剂：0.1mol/L盐酸溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、酚酞指示剂、甲基橙指示剂、葡萄糖标准溶液、淀粉溶液、过氧化氢溶液、酶制剂等。
四、实验步骤1. 酸碱滴定法测定氢氧化钠溶液浓度- 准备好0.1mol/L盐酸溶液、酚酞指示剂。
- 用碱式滴定管准确吸取一定体积的氢氧化钠溶液于锥形瓶中。
- 加入适量的酚酞指示剂，观察溶液颜色变化。
- 用酸式滴定管逐滴加入盐酸溶液，直至溶液颜色由粉红色变为无色，记录滴定终点。
- 根据消耗的盐酸体积计算氢氧化钠溶液的浓度。
2. 紫外-可见光谱法测定葡萄糖浓度- 准备好葡萄糖标准溶液、淀粉溶液、过氧化氢溶液。
- 将一定量的淀粉溶液与过氧化氢溶液混合，置于紫外-可见分光光度计中，测定吸光度。
- 将一定量的葡萄糖标准溶液与过氧化氢溶液混合，置于紫外-可见分光光度计中，测定吸光度。
- 根据比尔定律计算葡萄糖的浓度。
3. 酶活性测定- 准备好酶制剂、底物溶液、缓冲溶液。
- 将底物溶液与酶制剂混合，置于恒温水浴锅中。
- 定时取样，测定酶催化反应的速率。
- 根据反应速率计算酶的活性。
五、实验结果与分析1. 酸碱滴定法测定氢氧化钠溶液浓度- 消耗的盐酸体积为V1 mL，计算氢氧化钠溶液的浓度为C1 mol/L。
2. 紫外-可见光谱法测定葡萄糖浓度- 根据比尔定律，计算葡萄糖的浓度为C2 mol/L。
生物化学实验层析技术和原理
层析技术一、层析技术是利用混合物中各组分理化性质的差别（分子亲和力、吸附力、分子的形状和大小、分配系数等），使各组分以不同程度分布在两个相，其中一个是固定相，另一个是流动相，从而使各组分以不同速度移动而使其分离的方法。
二、常用的层析技术有亲和层析、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、分配层析五种。
层析方法分类表（l ）层析柱层析柱一般为玻璃管制成，其下端为细口，出口处带有玻璃烧结板或尼龙网。
柱的直径和长度之比是1：10~40层析柱的内壁直径大于1cm ，以防产生“管壁效应”，即由于流动分子在柱中心移动慢，沿管壁移动快，而使区带成为凸形的现象。
当层析的目的是要把小分子物质分离开，则层析柱体积应是样品体积的4一10倍。
高度与直径比是5:1一15:1。
当层析的目的是要分离大分子物质时，则层析柱的体积应为样品体积的25—100倍，高度直径比为一100:1。
）（2）恒流装臵在层析过程中，必须保证流动相流过固定相。
因此试剂的加人必须有恒流装臵加以控制。
最简单的恒流装臵是恒压瓶（Mariotte 瓶）这实际上是一下口瓶，其塞上插人一根玻璃管。
它通过密封的层析柱和环境之间大气压的平衡来控制洗脱液的流速。
当洗脱液流出瓶子后，在剩下的溶液顶部就产生部分真空，管A 内溶液的水平面就下降，当下降到管的末端，空气就进人容器，出现气泡。
管A 最下端压力等于大气压。
静水压是从B 点算起，与瓶中溶液深度无关。
这个压力恒定的，因此洗脱液的流三、1、柱层析的设备洗脱液扌尼龙网 检测器 记录仪1M o自动部分收集器寻呂一洗观液玻璃棉 ~层析柱萍一固定相 恒液泵柱层析的基本设备有层析柱，恒流装臵（恒流泵，它可以产生均一的流速，并且流速是可调的）和接收装臵。
出速度是恒定的。
恒压瓶装臵简单，但洗脱液流出速度不好整制。
另一种恒流装臵是恒流泵，它可以产生均一的流速，（3）接受装臵洗脱液的接收可以手工用试管一管一管地接。
不过最好使用部分收集器，这种仪器带有上百支试管，可准确定时换管、自动化程度很高。
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验（一）糖类的颜色反应一、实验目的1、了解糖类某些颜色反应的原理。
2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。
二、颜色反应（一）α-萘酚反应1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚生成紫红色物质。
因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。
2、器材试管及试管架，滴管3、试剂莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶内。
用前配制。
1％葡萄糖溶液100 mL1％果糖溶液100 mL1％蔗糖溶液100 mL1％淀粉溶液100 mL0.1％糠醛溶液100 mL浓硫酸 500 mL4、实验操作取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、0.1％糠醛溶液各1 mL。
再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。
倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。
观察记录各管颜色。
（二）间苯二酚反应1、原理在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。
此反应是酮醣的特异反应。
醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。
实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。
2、器材试管及试管架，滴管3、试剂塞氏试剂：0.05％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。
1％葡萄糖溶液100 mL1％果糖溶液100 mL1％蔗糖溶液100 mL4、实验操作取3试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液各0.5 mL。
再向3支试管中各加入塞氏试剂5 mL，充分混合。
将试管同时放入沸水浴中，。
观察记录各管颜色。
(二)糖类的还原作用一、实验目的1、理解并掌握糖类的还原性质；2、学习常用的鉴定糖类还原性的方法。
植物生理生化实验原理和技术
植物生理生化实验原理和技术植物生理生化实验旨在研究植物生命过程中的生理和生化相关現象，改进对植物的了解及应用。
以下是实验原理和常用技术。
1. 光合作用测定：光合作用是植物生理的重要过程之一，可使用光合速率仪测量光合速率。
原理是通过测量植物叶片释放或吸收的氧气量，来间接测定光合速率。
2. 蒸腾作用测定：蒸腾作用是植物水分代谢的关键环节。
可利用蒸腾速率仪测量植物叶片释放的水蒸气量，从而确定植物的蒸腾速率。
3. 细胞呼吸测定：细胞呼吸是植物细胞产能的主要途径，可以通过测量释放的二氧化碳量来测定细胞呼吸速率。
常用的测定方法有测量呼吸速率的气体分析仪或密闭系统测定二氧化碳的累积。
4. 酶活性测定：酶是植物生物化学过程中的重要催化剂。
酶活性的测定可以通过测量糖类、蛋白质、核酸等底物的代谢速率，或通过测量底物与产物之间的光学、电化学变化来实现。
常用的方法有光谱法、酶促反应连续监测法等。
5. 色素提取：植物体内的色素对光合作用和其他生化过程至关重要。
常用的色素提取方法包括酒精提取、乙醚提取等。
提取后的色素溶液可以通过紫外-可见光谱仪进行定量测定。
6. 蛋白质测定：蛋白质是植物细胞内的重要有机物。
常用的蛋白质测定方法包括巴雷特试剂法、劳氏试剂法、比色试剂法等。
通过测定样品和标准溶液的吸收值，可以计算出蛋白质的含量。
7. 酶动力学测定：酶动力学是研究酶催化作用速度的科学。
可以通过测定底物浓度、酶浓度、反应时间等因素对酶活性的影响来研究酶的催化机理。
常用的测定方法有Michalis-Menten曲线法、双倒数法等。
8. 膜透性测定：膜透性是指物质穿过细胞膜的能力。
可以通过测定溶液中离子浓度的变化，来评估膜透性的改变。
常用的测定方法有电导率法、吸光度法等。
9. RNA/DNA提取和定量：RNA/DNA是植物遗传信息的主要表达形式。
可以使用相关试剂盒从植物样品中提取RNA/DNA，然后通过紫外-可见光谱仪或荧光定量仪测定其浓度。
王宪泽 生物化学实验技术原理和方法
王宪泽生物化学实验技术原理和方法一、引言生物化学实验技术是生物化学研究中不可或缺的工具，它通过对生物分子的分离、纯化和定量等步骤，揭示了生物分子的结构和功能，为生物化学研究提供了重要的实验依据。
本文将介绍王宪泽生物化学实验技术的原理和方法，包括生物分子的提取与纯化、酶活性的测定以及分子生物学技术的应用等方面。
二、生物分子的提取与纯化在生物化学实验中，首先需要从生物样品中提取目标分子，如蛋白质、核酸等。
提取方法根据目标分子的特性和样品的属性选择不同的方法。
常用的提取方法包括破碎法、溶解法和离心法等。
其中，破碎法通过机械力或化学方法破坏细胞结构，释放目标分子；溶解法则利用溶剂将目标分子从细胞中溶解出来；离心法则通过离心过程将目标分子从细胞碎片中分离出来。
提取得到的混合物需要进一步纯化，常用的纯化方法有柱层析、凝胶电泳和过滤等。
这些方法可以根据分子的大小、电荷和亲和性等特性进行选择，以获得纯度较高的目标分子。
三、酶活性的测定酶是生物体内的重要催化剂，其活性的测定对于研究酶的功能和特性具有重要意义。
常用的酶活性测定方法有比色法、荧光法和放射性测定法等。
比色法通过测量产生的色素在可见光谱范围内的吸光度变化来确定酶活性；荧光法则利用酶催化产生的荧光信号来测定酶活性；放射性测定法则利用放射性同位素标记底物，在酶催化下测定底物的放射性变化来确定酶活性。
这些方法可以根据酶的底物和产物的特性进行选择，以获得准确的酶活性测定结果。
四、分子生物学技术的应用分子生物学技术在生物化学研究中起着重要的作用，它通过对生物分子的DNA、RNA和蛋白质等进行分析，揭示了生物分子的结构和功能。
常用的分子生物学技术包括PCR、DNA测序和蛋白质质谱等。
PCR是一种重要的DNA扩增技术，可以在体外大量复制DNA片段；DNA测序则可以确定DNA序列，揭示基因的组成和功能；蛋白质质谱则可以鉴定蛋白质的序列和修饰，分析蛋白质的结构和功能。
这些技术的应用为生物化学研究提供了强有力的工具，推动了生物化学领域的发展。
生物化学实验层析技术和原理
生物化学实验层析技术和原理层析技术的原理是，流动相沿固定相或凝胶材料均匀流动，并与样品中的成分发生相互作用。
在这个过程中，不同成分的分布系数不同，一部分样品成分将分配到固定相上，而其他成分将留在流动相中。
随着流动剂的稳定流动，样品成分会相对稳定地分布在固定相和流动相之间，从而实现分离。
层析实验中最常用的固定相是硅胶或氨基硅胶。
这两种固定相具有相亲性和分离成分的能力。
流动相（也称为溶剂）的选择取决于样品性质和需要分离的成分。
流动相可以是有机溶剂或水溶液，通常会根据不同的系统进行优化。
层析技术主要有几种类型：薄层层析、柱层析、凝胶层析和高效液相层析（HPLC）。
薄层层析是最简单和最常见的层析方法之一、它使用涂覆在玻璃或塑料板上的薄层介质，如硅胶或氯化铝，将样品分离成各个成分。
样品在薄层介质上展开，然后通过浸泡或喷涂内外的化学试剂来显色，以使成分显示为不同的带状。
可以使用紫外线或其他光源进行检测和定量。
柱层析也是常用的分离技术之一、它通常使用石英柱或玻璃柱作为固定相，流动相通过柱子进行分离。
样品在柱子上负荷后，使用适当流动相进行洗脱。
根据样品的性质和需要，可以选择不同类型的柱子和流动相。
例如，在反相层析中，疏水性柱子配合有机溶剂流动相可分离疏水性成分。
凝胶层析使用凝胶作为固定相，通常使用聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶。
在凝胶层析中，样品分子通过固定凝胶孔隙之间的透明度差异进行分离。
根据样品的大小和需要进行选择凝胶孔隙的大小，以实现目标成分的分离。
HPLC是一种高效、自动化和精确的层析技术。
它使用高压泵将流动相推入柱子中，并使用检测器实时监测和记录分离的成分。
HPLC通常选择高分辨率的固定相，如硅胶、氨基硅胶或C18柱。
HPLC可以根据需要使用各种流动相和检测器，例如紫外光检测器或质谱检测器。
层析技术在生物化学领域中具有广泛的应用。
它可以用于从生物样品中纯化蛋白质、核酸、酶和药物等目标物质。
层析技术的选择取决于样品的特性、目标物的大小和属性，还有需要分离和纯化的成分的数量。
基础生物化学实验报告
一、实验目的1. 掌握基础生物化学实验的基本操作技能。
2. 了解生物大分子的性质和结构。
3. 培养严谨的科学态度和实验习惯。
二、实验原理生物大分子是生物体内重要的组成部分，主要包括蛋白质、核酸、多糖等。
本实验通过观察和比较不同生物大分子的性质和结构，加深对生物大分子的认识。
三、实验器材与试剂1. 器材：显微镜、离心机、电泳仪、紫外可见分光光度计、紫外灯、移液器、吸管、烧杯、试管等。
2. 试剂：蛋白质、核酸、多糖样品，生理盐水，染色剂，缓冲液等。
四、实验步骤1. 蛋白质鉴定实验（1）观察蛋白质样品的外观，记录颜色、形态等特征。
（2）用生理盐水制备蛋白质溶液，记录浓度。
（3）观察蛋白质溶液的透明度，记录是否出现浑浊现象。
（4）将蛋白质溶液滴加到试管中，加入染色剂，观察颜色变化。
2. 核酸鉴定实验（1）观察核酸样品的外观，记录颜色、形态等特征。
（2）用生理盐水制备核酸溶液，记录浓度。
（3）观察核酸溶液的透明度，记录是否出现浑浊现象。
（4）将核酸溶液滴加到试管中，加入染色剂，观察颜色变化。
3. 多糖鉴定实验（1）观察多糖样品的外观，记录颜色、形态等特征。
（2）用生理盐水制备多糖溶液，记录浓度。
（3）观察多糖溶液的透明度，记录是否出现浑浊现象。
（4）将多糖溶液滴加到试管中，加入染色剂，观察颜色变化。
4. 蛋白质、核酸、多糖分离实验（1）将蛋白质、核酸、多糖样品分别加入离心管中，加入适量缓冲液。
（2）用离心机进行离心，观察沉淀和上清液的颜色变化。
（3）用紫外可见分光光度计测定沉淀和上清液的吸光度，计算浓度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质鉴定实验结果蛋白质样品呈现白色固体，加入染色剂后变为红色，说明蛋白质具有染色特性。
2. 核酸鉴定实验结果核酸样品呈现白色固体，加入染色剂后变为蓝色，说明核酸具有染色特性。
3. 多糖鉴定实验结果多糖样品呈现白色固体，加入染色剂后变为红色，说明多糖具有染色特性。
4. 蛋白质、核酸、多糖分离实验结果蛋白质、核酸、多糖在离心过程中分别沉淀和溶解，说明它们在溶液中的溶解度不同。
生物化学实验原理和方法
生物化学实验原理和方法
高等级生物化学实验原理和方法是生物化学实验中实质上的原理和方法，它们将用于实现入门和研究目的，从而探索和理解细胞和有机体的生物学功能和结构。
一般而言，生物化学实验原理和方法可分为三大类：
1）分子生物学原理和方法：这些原理和方法用于研究细胞膜结构与功能，蛋白质结构与功能，以及基因结构和表达。
实验中常用的技术包括体外核酸扩增（PCR），蛋白质印迹（Western blot），DNA排序（DNA sequencing），等电点凝胶电泳（isoelectric focusing），聚丙烯凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis）等。
2）生物化学实验原理和方法：这些原理和方法用于研究有机体中特定有机酸，肽和蛋白质结构，以及酵母等微生物中的蛋白质的结构和功能。
常用的实验技术有酶抑制技术，免疫浆技术，特异性抗体制备技术，凝胶电泳，色谱技术和质谱技术等。
3）生物数学实验原理和方法：该原理关注数据处理，建模和统计等方面，可以应用于生物化学实验中，以更有效地提取有用信息。
常用的实验技术包括数据导入，模型拟合和统计分析等。
生物化学实验报告
实验一糖类的性质实验（一）糖类的颜色反应一、实验目的1、了解糖类某些颜色反应的原理。
2、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。
二、颜色反应（一）α-萘酚反应1、原理糖在浓无机酸（硫酸、盐酸）作用下，脱水生成糠醛及糠醛衍生物，后者能与α-萘酚生成紫红色物质。
因为糠醛及糠醛衍生物对此反应均呈阳性，故此反应不是糖类的特异反应。
2、器材试管及试管架，滴管3、试剂莫氏试剂：5％α-萘酚的酒精溶液1500mL.称取α-萘酚5g，溶于95％酒精中，总体积达100 mL，贮于棕色瓶。
用前配制。
1％葡萄糖溶液100 mL1％果糖溶液100 mL1％蔗糖溶液100 mL1％淀粉溶液100 mL0.1％糠醛溶液100 mL浓硫酸 500 mL4、实验操作取5支试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液、1％淀粉溶液、0.1％糠醛溶液各1 mL。
再向5支试管中各加入2滴莫氏试剂，充分混合。
倾斜试管，小心地沿试管壁加入浓硫酸1 mL，慢慢立起试管，切勿摇动。
观察记录各管颜色。
（二）间苯二酚反应1、原理在酸作用下，酮醣脱水生成羟甲基糠醛，后者再与间苯二酚作用生成红色物质。
此反应是酮醣的特异反应。
醛糖在同样条件下呈色反应缓慢，只有在糖浓度较高或煮沸时间较长时，才呈微弱的阳性反应。
实验条件下蔗醣有可能水解而呈阳性反应。
2、器材试管及试管架，滴管3、试剂塞氏试剂：0.05％间苯二酚－盐酸溶液1000 mL，称取间苯二酚0.05 g溶于30 mL浓盐酸中，再用蒸馏水稀至1000 mL。
1％葡萄糖溶液100 mL1％果糖溶液100 mL1％蔗糖溶液100 mL4、实验操作取3试管，分别加入1％葡萄糖溶液、1％果糖溶液、1％蔗糖溶液各0.5 mL。
再向3支试管中各加入塞氏试剂5 mL，充分混合。
将试管同时放入沸水浴中，。
观察记录各管颜色。
(二)糖类的还原作用一、实验目的1、理解并掌握糖类的还原性质；2、学习常用的鉴定糖类还原性的方法。
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生物化学实验原理与技术中国农业科学院研究生院生物化学与分子生物学教研室1999年 12月目录蛋白质化学部分实验一多酚氧化酶（PPO）的分离纯化 (4)实验二多酚氧化酶（PPO）的活性测定 (8)实验三考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度 (10)实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定 (12)实验五等电聚焦电泳法测定蛋白质等电点 (16)实验六多酚氧化酶（PPO）的同功酶检测 (19)免疫学部分实验七多酚氧化酶（PPO）抗体的制备 (24)实验八多酚氧化酶（PPO）扩散免疫电泳 (31)实验九多酚氧化酶（PPO）火箭免疫电泳 (33)实验十 Western bloting技术 (40)实验十一亲和层析法分离纯化胰蛋白酶 (44)核酸化学部分实验十二植物染色体DNA的提取 (52)实验十三质粒DNA的提取与纯化 (54)实验十四 DNA片断的酶切技术 (57)实验十五 DNA片断的连接技术 (59)实验十六受体菌感受态细胞的制备 (61)实验十七重组DNA片断的转化、克隆及筛选 (62)作业实验结束后按实验指导的格式写出实验报告，其中包括：实验目的与原理；材料与方法；实验结果与分析；实验结果讨论。
实验结果照片、图表等要附在实验报告中。
蛋白质化学部分实验一多酚氧化酶（PPO）的分离、纯化一、实验原理与目的多酚氧化酶（儿茶酚酶），它是植物组织内广泛存在的一种含铜氧化酶，位于质体、微体内，可参与植物生长、分化和种皮透性的调节。
植物受到机械损伤和病菌侵染后，PPO催化酚与O2氧化形成为醌，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。
醌类物质对微生物有毒害作用，所以伤口醌类物质出现是植物防止伤口感染的愈伤反应，因而受伤组织一般这种酶的活性就会提高。
多酚氧化酶的活性与植物抗病有一定联系，植物免疫与动物免疫的机理不同，后者是抗体与抗原的关系，前者的免疫机理现在认为主要是产生对病源有害物质。
已发现具有免疫作用的有害物质是多种多样的，概括为两种类型，其中的一种类型就是原有的有毒物质，植物本身含有的一些对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长。
很早就发现酚类化合物与抗病有明显的相关，例如原儿茶酸与儿茶酚对有色洋葱磷茎炭疽病菌的抑制作用。
多酚氧化酶也可与细胞内其他底物氧化相偶联，起到末端氧化酶的作用：＋+醌2O底物+酚2但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因之一，影响一些经济植物产品的质量。
在制茶加工工业中这种酶有重要作用，在制茶时要立即杀青，防止多酚氧化酶的活性，避免醌类物质的产生，保持茶色清香。
因此，许多学者对此进行研究，并从一些植物组织中分离纯化这种酶，研究酶的理化性质和生化特性。
本实验将采用马铃薯为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸铵沉淀、透析等步骤获得PPO的粗酶液；再经过阴离子交换柱DEAE－纤维素DE－52柱层析、聚乙二醇反渗透浓缩、葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析获得PPO的纯酶液；然后对其进行酶蛋白含量检测、酶活性测定、聚丙烯酰胺凝胶电泳和PPO同功酶的分析，以及通过免疫学的分析对多酚氧化酶（PPO）进行理化、生化特性进行鉴定。
通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离、纯化、鉴定的系统技术。
二、材料（1）马铃薯（大约每小组100-200g）（2）试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）配制时配×10倍浓缩液100ml；0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）配制时配×10倍浓缩液1000ml；NaCl:聚乙二醇：DEAE－纤维素 DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G-200:（3）实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋：过滤纱布；层析柱；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；恒流泵；梯度混合仪；核酸蛋白检测议；GL－20C 高速冷冻离心机；DL－7A 大容量低速冷冻离心机：三、方法与步骤（1）粗酶提取：水果肉组织按1:1（W/V）比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，5％甘油，1％的聚乙烯吡咯烷酮）混合，匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。
（2）硫酸铵沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵使其达到40％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸铵达到70％饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0.03M磷酸缓冲液pH6.0（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl 溶液透析至无硫酸铵根离子，获得粗酶液供上柱使用。
（3）DEAE－纤维素DE 52离子交换柱层析（DE 52的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义附）：选用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE－52柱进行平衡，然后将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白，再换用含NaCl（0.2-0.6 M）的0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）进行梯度洗脱；收集PPO活性部分洗脱液，采用聚乙二醇反渗透法浓缩酶液2倍供羟基磷灰石柱层析用。
（4）葡聚糖凝胶Sephadex G-200凝胶柱层析（Sephadex G-200凝胶的材料处理、装柱方法、层析方法和原理见实验讲义的第5页）：用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先平衡Sephadex G-200凝胶,然后将酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。
实验二多酚氧化酶（PPO）活性测定一、原理与方法PPO催化各种酚与0氧化为醌。
本实验是采用邻苯二酚为底物，在 0.2M2磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO的酶活大小。
其方法是，在含有4ml pH5.8的0.2M磷酸二氢钠－0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05ml 0.05M邻苯二酚溶液,在30℃恒温水浴中预热后加入0.05ml 酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。
在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01 OD值定义为一个酶活单位（U）。
二、材料（1）样品：多酚氧化酶粗酶液硫酸铵沉淀组份DE－52洗脱组份羟基磷灰石洗脱组份Sephadex G-200的组份（2）底物：邻苯二酚：0.01M邻苯二酚溶液（3）反应体系：0.2M磷酸氢二钠－0.1M柠檬酸缓冲液pH5.8（4）器皿与仪器：试管、恒温水浴等分光光度计三、酶蛋白的比活性比活性＝酶活单位（U）/mg 酶蛋白四、记录实验结果（1）结果列表多酚氧化酶的提取、分离、纯化表（2）根据实验结果绘制DE－52和G－200的柱层析洗脱曲线图。
实验三考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度一、实验原理与目的生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质测定方法有紫外吸收法，双缩脲法和Lawry法等。
另一种方法是蛋白质－染料结合法，即考马斯亮蓝G－250法。
此方法试剂简单、经济。
测定简便快速。
具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其他物质的干扰很小，可采用对照来消除。
考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质浓度的基本原理是：当考马斯亮蓝G－250染料与蛋白质结合时，其存在两种不同颜色（红色与蓝色），红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465 nm移动到595 nm，染料与蛋白质的结合与595 nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线性相关，其蛋白结合反应在2－3 min内即可完成，而反应生成的复合物在1 h内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白测得O.D595值绘制标准曲线，即可求得待测样品的蛋白质浓度。
二、材料与方法1.材料：经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE－纤维素DE 52分离的酶液和Sephadex G－200分离纯化的酶液样品。
2.仪器与器皿：分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。
3.试剂：（1）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G－250溶于50 ml 90％的乙醇中，加入85％（V/V）磷酸100 ml，最后加无离子水或蒸馏水定溶到1000 ml，此溶液可在常温下放置一个月。
（2）蛋白标准液：称取牛血清蛋白100 mg定溶于100 ml的无离子水或蒸馏水中，制成1000 μg / ml贮备液。
再配制成分别为20 μg/ml、40 μ g/ml、60 μg/ml、80 μg/ml、100 μg/ml的蛋白标准液。
4.测定方法与操作步骤：（1）标准曲线的绘制：0－100 μg/ml蛋白标准曲线：准确吸取0.5 ml含20、40、60、80、100 μg蛋白标准液，分别放入10 ml的试管中，加5.0 ml考马斯亮蓝G－250蛋白试剂，将溶液混匀，2 min后在分光光度计594 nm处测定其消光值，空白以无离子水或蒸馏水代替。
以消光值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
100－1000 μg/ml的蛋白标准曲线的制作方法上述相同。
（2）样品中蛋白质浓度的测定：要求待测样品中的蛋白浓度范围为1－1000 μg/ml之间，若浓度过高时，需要对其进行适当的稀释，再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的O.D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白质浓度。
实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。
1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（SDS），大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4 g的SDS，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS－复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与所带电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：MW＝K（10 -－b m）MW－为蛋白质分子量K－为常数b－为斜率m－为迁移率不同浓度的凝胶适用于不同蛋白质分子量范围，在5％的凝胶中分子量25000～200000的蛋白质；在10％的凝胶中，分子量10000～70000的蛋白质；在15％的凝胶中，分子量10000～50000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系。