杂交瘤技术和单克隆抗体技术
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Koehler和Milstein在体细胞融合技术的基础上创立了淋巴细胞杂交瘤（hybri-doma)技术，他们将丧失合成次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞举行融合，融合的细胞不仅可以延续传代，而且能分泌抗绵羊红细胞的单克隆抗体，这项技术开创了医学与生物学基础讨论的新纪元。
杂交瘤技术具有周期长，高度延续的特点，涉及大量组织细胞培养，细胞免疫学和免疫化学等办法。
一、杂交瘤技术的原理 B淋巴细胞接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，是重要的体液免疫细胞。
B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再举行细胞分裂。
骨髓瘤细胞是恶性增殖的转化细胞，通过细胞融合技术将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所产生的融合细胞既具有亲本骨髓瘤细胞的无限繁殖的生物学特性，又具有另一亲本B淋巴细胞合成、分泌特异性抗体的能力。
B淋巴细胞杂交瘤技术的原理可以从以下三个关键之处来阐明：首先是细胞融合剂的挑选，用法细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于互相粘连而融合在一起。
最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。
（PEG1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，普通应用浓度为40% (W/V)。
第二，细胞融合的挑选培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤( hypoxanthine, H )、甲氨蝶吟( aminopterin, A）和(thymidine, T )，所以取三者的字头称为HAT培养基。
甲氨蝶吟是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。
惟独融合细胞具有亲代双方的遗传性能，能在HAT培养基中长久存活与繁殖。
第三，细胞融合是随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。
筛选过程普通分为两步举行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上举行的特异性抗体筛选，从而找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后举行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养，这一过程称作克隆化。
简述杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理。
简述杂交瘤技术生产单克隆抗体的原理。
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杂交瘤技术和单克隆抗体技术PPT课件模板
制备单克隆抗体
从筛选得到的杂交瘤 细胞中提取单克隆抗 体，进行纯化和定量 。
应用单克隆抗体
将单克隆抗体应用于 临床诊断、治疗和基 础研究等领域。
单克隆抗体技术的实验操作流程
免疫原制备
制备免疫原，如抗原蛋白或多糖等，并进行 纯化和定量。
免疫动物
将免疫原注射入动物体内，刺激机体产生特异 性抗体。
制备杂交瘤细胞
杂交瘤技术和单克隆
抗体技术ppt课件模
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2024-01-11
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较 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的实
验操作流程 • 杂交瘤技术与单克隆抗体技术的应
用案例
01
杂交瘤技术简介
杂交瘤技术的定义
杂交瘤技术是一种将免疫系统的B淋巴细胞与骨髓瘤细 胞融合，形成杂交瘤细胞的技术。
单克隆抗体的应用领域
01 肿瘤诊断与治疗
用于肿瘤的早期诊断、靶 向治疗、免疫治疗等。
03
免疫性疾病。
02 感染性疾病
用于诊断和治疗病毒性肝 炎、艾滋病等感染性疾病 。
04 心血管疾病
用于诊断和治疗冠心病、
心肌梗死等心血管疾病。
杂交瘤技术与单克隆抗体技
杂交瘤技术与单克隆抗体技
04
术的实验操作流程
杂交瘤技术的实验操作流程
准备免疫动物
选择适宜的免疫动物 ，如小鼠或大鼠，并 进行免疫接种，刺激 机体产生特异性抗体 。
制备杂交瘤细胞
将免疫动物的脾细胞 与肿瘤细胞融合，形 成杂交瘤细胞。
克隆化筛选
通过选择性培养基筛 选出能够产生所需抗 体的杂交瘤细胞，并 进行克隆化培养。
杂交瘤技术和单克隆抗体技术
四、免疫系统能将外来微生物和分子与本身成份区别开来。
五、系统记忆每一次与外来抗原旳遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆能够延续动物终身。
六、免疫反应旳许多性质是经过克隆选择拟定旳
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。
重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体旳区别
IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们旳重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。
重链旳不同使这些蛋白具有不同形式旳免疫功能，而且在 完毕反应成熟旳不同阶段发挥作用。这些差别主要是因为Fc 片段上旳蛋白序列不同所致。
四、抗体重链旳分子构造
重链旳序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链具 有一种可变区和三个恒定区，每区含110个氨基酸，其他重 链具有附加旳恒定区。
IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链旳可变区形成抗原结合位点
B细胞：分泌抗体，并在细胞表面携带同一抗体旳修饰型， 功能相当于受体。
毒性T细胞：携带结合抗原旳细胞表面受体。 辅助T细胞：在控制B细胞和细胞毒性T细胞反应方面起关 键旳调整作用。
体液介导旳适应性免疫反应：体液反应引起产生可结合外 来抗原旳循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术旳基础。
HAT选择培养基：HAT培养基是指在细胞培养基中加有次黄 嘌呤（H）、氨基喋呤（A）或氮丝氨酸（A）和胸腺嘧啶核 苷（T）旳培养基。细胞为合成DNA所需要旳嘌呤和嘧啶，可 由两条途径取得。一条为主要途径，即从磷酸核糖焦磷酸 （PRPP）和谷氨酰胺合成肌苷酸（IMP），进而转变为脱氧 鸟苷三磷酸（dGTP），及从脱氧尿苷酸（dUMP）合成脱氧 胸苷酸（dTMP），再转变为脱氧胸苷三磷酸（dTTP）。这 一合成途径，可为加入旳会克制为嘌呤或嘧啶合成提供甲基旳 二氢叶酸还原酶旳叶酸类似物A所阻断。此时，只有HGPRT+ 和TK+细胞才干经过另一条应急途径，利用外加旳核苷酸旳 “前体”H来合成IMP和利用T来合成dTMP，而得以有活下 来。相反，HGPRT－和TK－细胞则将因无法利用H和T来合成 DNA而死亡。所以，在HGPRT－和TK－细胞融合后，应用 HAT培养基即可将经过基因互补而同步取得HGPRT和TK酶 旳杂种细胞筛选出来。
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理一、引言单克隆抗体（Monoclonal Antibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的抗体，具有高度特异性和亲和力。
其制备方法主要有杂交瘤技术、酶联免疫吸附试验法（ELISA）、荧光激发技术等。
其中，杂交瘤技术是制备单克隆抗体最重要的方法之一。
二、杂交瘤技术基本原理1. B细胞与肿瘤细胞的融合杂交瘤技术的基本原理是将体内产生的特异性抗体B细胞与无限增殖能力的肿瘤细胞进行融合，形成可分泌大量同种特异性抗体的杂交瘤细胞。
在此过程中，B细胞提供了高度特异性的抗体基因组，而肿瘤细胞提供了无限增殖能力。
2. 杂交瘤细胞筛选和分离将获得的杂交瘤细胞进行筛选和分离，以获取单一同种特异性抗体产生的杂交瘤细胞株。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制，以确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力。
3. 单克隆抗体的大规模制备通过对单克隆抗体杂交瘤细胞株进行培养和扩增，可以大规模制备单克隆抗体。
此过程中需要注意对培养条件、生长因子、营养物质等进行优化，以提高单克隆抗体的产量和质量。
三、杂交瘤技术的优点1. 高度特异性和亲和力通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，可以用于检测、诊断、治疗等领域。
2. 无限复制能力杂交瘤细胞具有无限复制能力，可以大规模制备同种特异性抗体。
3. 可重复性好由于单一B细胞产生的同种特异性抗体都是完全相同的，因此通过杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体具有良好的可重复性。
四、杂交瘤技术存在的问题及解决方法1. 杂交瘤细胞的稳定性杂交瘤细胞的稳定性对于单克隆抗体的制备至关重要。
为了提高杂交瘤细胞的稳定性，可以采用多种方法，如对培养条件进行优化、添加生长因子等。
2. 克隆选择在杂交瘤技术中，克隆选择是一个非常重要的环节。
为了确保所得到的单克隆抗体具有高度特异性和亲和力，需要对杂交瘤细胞进行筛选和分离。
这里需要注意的是，筛选和分离的条件需要严格控制。
杂交瘤技术制备单克隆抗体PPT医学课件
HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要 途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT和TK 缺乏，DNA合成的替代途径受阻 融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋 巴细胞的HGPRT和TK，可采用补救途径合成DNA， 因此可在HAT培养基上存活和繁殖。
免疫脾细胞
处于免疫状态脾脏中的B淋 巴母细胞或浆母细胞
动 物：
6～12周龄 20g～25g体重
2、骨髓瘤缺陷细胞株的培养和选择
对骨髓瘤细胞的要求：
（1）与免疫动物属同一品系（融合效率高、便于接种杂交瘤细胞在同一品 系小鼠腹腔中产生大量的单克隆抗体。） （2）选择HGPRT—株（次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型)或TK（胸 腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞（细胞系在核酸类似物存在时会产生 HGPRT缺乏的突变株，该突变株不能在HAT培养基上生长。） (3)在细胞融合前两周复苏骨髓瘤细胞，保证骨髓瘤细胞处于对数 生长期。
骨髓瘤细胞的培养
1、采用一般的动物细胞培养液，小牛血清的浓度一般 在10%~20%，细胞的最大密度不得超过106cells/mL。
2、骨髓瘤细胞可以悬浮或半贴壁形一 般扩大培养以1:10稀释传代。）
HAT选择培养基的原理
HAT培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要 途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替 代途径合成DNA
杂交瘤细胞的选择性培养
细胞DNA合成途经：
1.正常途径： 糖、氨基酸 核苷酸 DNA(可被A-氨基蝶呤阻断) 2、补救途径： 核苷酸前体 核苷酸 DNA （需要次黄嘌呤鸟嘌呤
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理
利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理介绍在生物医学研究和临床诊断中，单克隆抗体作为一种重要的实验工具和治疗药物被广泛应用。
其中，利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体具有高特异性和高亲和力的特点，成为研究人员的首选。
本文将介绍利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理。
杂交瘤技术概述杂交瘤技术是一种将体外培养的B细胞（淋巴细胞瘤）与骨髓瘤细胞融合，从而形成能够长期生长并分泌抗体的细胞株的方法。
这种技术利用了淋巴细胞瘤的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限生长能力，使得细胞株能够持续产生具有特定结构和功能的单克隆抗体。
杂交瘤技术的步骤利用杂交瘤技术制备单克隆抗体一般包括以下几个步骤：1. 免疫原注射首先，在动物体内注射免疫原，激发机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂质等。
免疫原的选择要根据研究目的和所需抗体的特异性来确定。
2. B细胞提取从动物体内采集淋巴组织，提取出具有特异性抗体的B细胞。
B细胞是产生抗体的主要细胞类型，其具有表面上能与抗原结合的B细胞受体（BCR）。
3. 骨髓瘤细胞准备获得与B细胞体表BCR相对应的骨髓瘤细胞株。
骨髓瘤是一种恶性浆细胞增生性疾病，该病的细胞具有无限生长的能力。
4. 细胞融合将提取的B细胞与骨髓瘤细胞进行体外融合，形成杂交瘤细胞。
融合细胞的过程一般利用聚乙二醇（PEG）或电脉冲等方法实现。
5. 杂交瘤细胞筛选将杂交瘤细胞进行培养，并添加合适的选择性培养基，筛选出能够分泌特异性抗体的单个细胞克隆。
6. 单克隆抗体制备从筛选出的单个细胞克隆中，取出细胞进行进一步培养和扩增。
细胞培养过程中，单克隆细胞会不断分裂和分泌抗体，从而得到大量的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的原理利用杂交瘤技术制备单克隆抗体的原理主要基于两个关键特性：1. B细胞多样性B细胞具有多样的B细胞受体，这使得它们能够识别和结合各种不同的抗原。
当机体暴露于免疫原时，B细胞会通过BCR与特异性抗原结合，并启动免疫反应。
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤
什么是杂交瘤技术？杂交瘤技术的原理及步骤杂交瘤技术（hybridoma technique）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
这一技术的基础是细胞融合技术。
骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。
如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。
杂交瘤技术原理及步骤：杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。
这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。
被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。
在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。
其原理从下列3个主要步骤阐明。
(一)细胞的选择与融合建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。
脾是B细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。
融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。
·选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。
多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。
使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。
杂交瘤技术与单克隆抗体概要
杂交瘤技术与单克隆抗体概要（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）摘要：用绵羊红细胞免疫B A L B / C 小鼠, 取其脾淋巴细胞与同品系小鼠的骨髓瘤细胞融合, 形成的杂交细胞能分泌脾淋巴细胞的单一型抗体分子, 又具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性。
这种杂交细胞叫做杂交瘤。
杂交瘤能在离体培养条件下分泌抗体,如果移植在同品系或F 1小鼠体内, 在其血清或腹水中可以获得较高浓度的抗体。
这种抗体是由单一增殖的纯系细胞分泌的单克隆抗体。
由于其纯度高、特异性强、可以复制[1],这种技术自问世以来已广泛应用于疾病的免疫诊断、免疫治疗和免疫预防等各个领域[2]。
本文对杂交瘤技术的基本原理、程序、工作中注意问题、优点及应用等进行了综述。
关键词：杂交瘤技术基本原理程序注意问题优点应用自从1975年Kohler和Milstein建立杂交瘤技术以来[3]，淋巴细胞杂交瘤技术在许多研究实验室成为产生特异性抗体的重要工具，日益引起基础科学和临床工作者以及工业家的注意[4]。
许多科技工作者开展了这项新的生物技术的研究和应用,该技术不仅促进了现代医学、微生物学、肿瘤学、免疫学、寄生虫学和药学等学科的发展，并且正在从生物医学领域向工业、农业和牧业等新领域渗透，取得了一定的成果。
[5] 对其今后的发展和应用，N.A.5taines[6]和A.W.Edwards[7]都有较详细的叙述。
1979年我国引入了这项技术，并分别在北京、上海举办多次培训班，推广该项技术,[8]开展了杂交瘤技术的研究[9-10],并且取得显著成绩，但是由于国内的设备和物资条件的影响，杂交瘤技术开展比较慢，仍需迎头赶上。
1 单克隆抗体的概念单克隆抗体是由一个淋巴细胞增殖分化形成一个基因相同的细胞群称为克隆，或无性繁殖细胞系（简称细胞系），由单一克隆产生的抗体称为单克隆抗体。
众所周知，我们人体或动物体受天然抗原刺激后产生的抗体是多种抗体组成的混合抗体，即所谓的多克隆抗体。
单克隆抗体的鉴定
单克隆抗体的鉴定引言：单克隆抗体是一种重要的生物医学研究工具，可用于疾病的诊断、治疗和药物研发等领域。
单克隆抗体的鉴定是确保其特异性、亲和性和稳定性的重要步骤，以保证其在实际应用中的准确性和可靠性。
本文将介绍单克隆抗体鉴定的基本原理、常用的鉴定方法和相关的实验步骤。
一、单克隆抗体鉴定的基本原理单克隆抗体鉴定的基本原理是通过筛选和鉴定细胞克隆，确定具有特定抗原识别能力的单个细胞克隆，然后将其扩增并纯化得到单克隆抗体。
鉴定的关键在于筛选出具有高特异性、高亲和力和稳定性的单克隆抗体。
二、单克隆抗体鉴定的常用方法1. 杂交瘤技术：杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体鉴定方法之一。
该技术通过将抗原刺激的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，然后通过限稀稀释法或酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
2. 胶体金法：胶体金法是一种快速、灵敏的单克隆抗体鉴定方法。
该方法利用胶体金颗粒与抗原或抗体的特异性结合，形成可见的颜色反应，通过观察颜色变化来确定是否存在特定的抗原-抗体反应。
3. 免疫组化技术：免疫组化技术是一种广泛应用于单克隆抗体鉴定的方法。
该技术通过将细胞或组织样本与单克隆抗体反应，然后通过显色剂或荧光染料来观察特定抗原的表达情况，以判断单克隆抗体的特异性和亲和力。
三、单克隆抗体鉴定的实验步骤1. 抗原制备：首先需要制备纯化的抗原，可通过基因工程技术获得重组蛋白或通过提取生物体中的抗原蛋白。
2. 免疫动物免疫：将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 杂交瘤细胞融合：将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞筛选：通过限稀稀释法或ELISA等方法筛选出特异性抗原的单克隆抗体。
5. 单克隆抗体扩增：将筛选出的单克隆抗体进行扩增，并经过多次培养和纯化，以获得足够的纯净抗体。
6. 单克隆抗体鉴定：通过免疫组化技术、胶体金法等方法对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性、亲和力和稳定性。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
杂交瘤技术制备单克隆抗体1975年Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞与和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交瘤细胞既可产生抗体，又可无性繁殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破使血清学的研究进入了一个高度精确的新纪元。
免疫细胞化学的技术关键之一是制备特异性强、亲合力大、滴度高的特异性抗体，由于每种抗原都有几个抗原决定簇，用它免疫动物将产生对各个决定簇的抗体，即多克隆抗体。
单克隆抗体则是由一个产生抗体的细胞与一个骨髓瘤细胞融合而形成的杂交廇细胞经无性繁殖而来的细胞群所产生的，所以它的免疫球蛋白属同一类型，质地纯一，而且它是针对某一抗原决定簇的，因此特异性强，亲合性也一致。
单克隆抗体（McAb）的特性和常规血清抗体的特性比较见2-3。
表2—3 单克隆抗体（McAb）和常规免疫血清抗体的特性比较单克隆抗体制备的一般流程如下:单克隆抗体的制备方法如下。
（一）动物的选择与免疫1．动物的选择纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
目前开展杂交瘤技术的实验室多选用纯种BALA/C小鼠。
2．免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。
一般在融合前两个月左右根据确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
（1）可溶性抗原免疫原性较弱，一般要加佐剂，半抗原应先制备免疫原，再加佐剂。
常用佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）↓3周后第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）↓2～3周加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）↓3天后取脾融合目前，用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原）的免疫方案也不断有所更新，如：①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要制备步骤
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要
制备步骤
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术也称免疫杂交或抗体杂交，是用生物学和化学原理创造出人造抗体，也可以称之为“免疫抗体杂交”。
它通过将特定基因段无细胞化学合成抗体与正常正常抗体不同种型的B细胞经免疫球蛋白结合物外溶胶连接起来，从而锁定它们在杂交抗体分子内部而形成杂交细胞，它们同时具有正常抗体结构的灵活性，并将合成的抗体的特异性的目的物结合到杂交抗体分子上，诱导杂交细胞生长，从而获得特异性的抗体。
二、单克隆抗体的主要制备步骤
(1)筛选实验：将目标蛋白质与抗原结合，合成抗原——抗体复合物，获得具有抗原识别能力的抗体解析表型细胞。
(2)定向克隆：在筛选步骤的B细胞中采用定向克隆技术，将抗原识别能力特异的B细胞从其他不特异的B细胞中挑选出来，使它们成为抗体库中的杂交瘤。
(3)表达克隆抗体：将各自的表达株根据特定蛋白质的表达量分类，并从抗体库中培养出单克隆表达株。
(4)纯化抗体：从单个杂交瘤表达抗体株中分离，纯化抗体，获得纯净的单克隆抗体。
杂交瘤技术制备单克隆抗体
80%
筛选与培养
筛选出能产生所需抗体的杂交瘤 细胞，进行培养和扩增。
杂交瘤细胞的筛选与克隆化
抗体检测
采用酶联免疫吸附试验等方法 检测杂交瘤细胞产生的抗体。
阳性克隆筛选
筛选出能产生所需抗体的阳性 克隆。
克隆化
采用有限稀释法等方法对阳性 克隆进行克隆化，获得单克隆 抗体。
03
单克隆抗体的制备
细胞培养与单克隆抗体的产生
抗体鉴定
通过抗原-抗体反应、免疫电泳、质谱分析等方法，对单克隆抗体 的特异性、亲和力和分子量进行鉴定。
单克隆抗体的应用
01
02
03
04
生物医学研究
用于研究生物体内抗原、抗体 反应机制，以及疾病发生、发 展的机制。
诊断试剂
用于检测生物样本中的特定抗 原或抗体，辅助临床诊断。
靶向治疗
利用单克隆抗体与特定抗原的 结合能力，将药物或放射性物 质导向肿瘤等病变组织，提高 治疗效果和降低副作用。
杂交瘤技术的原理
杂交瘤技术的原理是利用细胞融合技术将免疫细胞与肿瘤细胞融合，形成 杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞既具有免疫细胞的抗体分泌能力，又具有肿瘤细胞的无限 增殖能力。
通过选择性培养基筛选出能够稳定分泌所需抗体的杂交瘤细胞，并进行克 隆化培养，最终获得高纯度、高亲和力的单克隆抗体。
02
杂交瘤的制备
商业前景与市场应用
诊断试剂
单克隆抗体可用于诊断试剂的研发来自提高检测的 特异性和灵敏度。生物治疗
单克隆抗体可用于肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾 病治疗等领域。
药物研发
单克隆抗体可用于药物靶点的发现和验证，加速 新药研发进程。
未来发展方向与展望
01
人源化单克隆抗体技术路线
人源化单克隆抗体技术路线
人源化单克隆抗体技术是一种用于制备治疗性抗体的方法，其基本技术路线如下：
1. 抗原选择：选择目标抗原，即希望产生抗体针对的特定蛋白质或分子。
2. 免疫动物：给动物（通常是小鼠）注射目标抗原，以诱导免疫反应。
3. 杂交瘤技术：从免疫动物的脾脏中分离出 B 淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
4. 抗体筛选：对杂交瘤细胞进行筛选，以找到能够产生针对目标抗原的特异性抗体的细胞株。
5. 抗体人源化：通过基因工程技术，将鼠源抗体的互补决定区（CDR）移植到人源抗体的框架区，从而构建出人源化抗体。
6. 表达和纯化：将人源化抗体基因导入适当的表达系统（如哺乳动物细胞、酵母或细菌）中进行表达，并通过纯化步骤获得高纯度的人源化单克隆抗体。
7. 功能和质量评估：对人源化单克隆抗体进行生物学活性、亲和力、特异性等方面的评估，以及进行质量控制和安全性测试。
8. 临床试验和批准：经过临床前研究后，将人源化单克隆抗体进行临床试验，以评估其安全性和有效性。
如果试验结果良好，该抗体可能获得监管机构的批准，用于临床治疗。
人源化单克隆抗体技术的发展使得治疗性抗体能够更好地应用于人类疾病的治疗，减少了免疫原性反应的风险，并提高了抗体的治疗效果。
这一技术在肿瘤治疗、自身免疫疾病治疗等领域具有重要的应用价值。
抗体技术的发展及应用
抗体技术的发展及应用抗体技术是指利用抗体作为工具或药物来研究或治疗疾病的一种技术。
自1975年瑞典科学家科赫与米尔斯坦在细胞融合过程中成功地将小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的混合瘤细胞，称为杂交瘤，从而首次成功制备了体外大量合成特异性抗体，抗体技术得到了迅速发展，如今已成为生物医学研究领域的重要工具之一。
抗体技术的发展主要经历了以下几个阶段：第一阶段是杂交瘤技术的发展。
早期，科学家们将B淋巴细胞与肿瘤细胞杂交形成杂交瘤，通过筛选和克隆等手段获得大量特异性抗体。
这一技术的发展使得制备特异性抗体的难度大大降低。
第二阶段是单克隆抗体（mAb）技术的发展。
1984年，科学家们成功地通过杂交瘤技术制备出了六抗，将其中一个抗体定制为由同一克隆细胞系分泌的抗体，即单克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性和单一性，广泛应用于免疫组织化学检测、流式细胞术、分子生物学等领域。
第三阶段是重组抗体技术的发展。
1990年，科学家们成功地将抗体编码的重链和轻链的DNA序列克隆到表达载体中，通过大肠杆菌表达重组抗体。
重组抗体技术使得抗体的生产更加可控和高效，大大提高了抗体的产量。
第四阶段是人源化抗体技术的发展。
由于小鼠抗体存在抗小鼠抗体反应的问题，科学家们开始研究人源化抗体。
通过将小鼠的特异性区域与人的常量区域进行重组，获得了人源化抗体。
这样的抗体可以更好地被人体接受，广泛应用于临床治疗。
抗体技术在许多领域有着广泛的应用。
首先，在医学研究领域，抗体技术被用于疾病的诊断和治疗。
例如，肿瘤标记物抗体可以用于早期癌症的检测，单克隆抗体可以用于特异性药物的传递。
其次，在生物学研究中，抗体技术被用于蛋白质的表达和定量，蛋白质的相互作用研究，以及细胞的表型分析等。
此外，抗体技术在农业、食品安全和环境监测等领域也有着重要应用。
总之，抗体技术经过数十年的发展，其应用范围已经非常广泛，不仅在医学研究和治疗中起到了重要作用，也在其他领域有着广泛的应用前景。
杂交瘤技术与单克隆抗体
作者研 究疾病诊断方法提供参 考资料。
关键字 ： 杂交瘤技术 ； 单克隆抗体
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ３ ６
文献标 识 码 ： Ｂ
文章编 号 ： １ ０ ０ ３ — ４ ８ ８ ９ （ ２ ０ １ ４） ０ ４ — ０ ０ ２ ６ — ０ ２
１ 杂 交瘤技 术 的原 理 与操作 流 程（ 见 图１）
【 ３ 】 杜红霞． 鸡毒霉形体代谢抑制性单克隆抗体 的研制及初步 应用． 硕 士学位论文 ． 武汉 ： 华 中农业大学， ２ ０ ０ ７ ．
于人为处理和质量控制 ，这些优点使它一问世就受
到高度重视 。单抗作为单一抗原决定簇 的分子识别 【 ４ ］ 顾 云， 张莉 ， 大野 尚仁 ． 鼠和兔 中流行性 感冒病毒抗体的 工具有其独特的优势 ， 除在生物医学基础研究 、 免疫 制备及测定【 Ｊ Ｊ ． 药物 生 物技 术 ， ２ ０ ０ ３ ， １ ０ （ ２ ） ： １ ０ ６ ． 和治疗方面得到广泛应用外 ，在疫病诊断和检疫 中 ［ ５ 】 贾世玉 ， 刘俊 华． 正辛酸与硫 酸铵 两步沉淀法纯化腹 水单 正在并将继续发挥重要作用。 为被动免疫而应用 ， 即单抗发挥主要作用。 它与病变 细胞结合 ，通过抗体介导的细胞毒性作用（ Ａ Ｄ Ｃ Ｃ ） ， 或者抗原抗体复合物激活补体来杀灭病变细胞 。实 践证明 ，用单克隆抗体直接注入动物体内治疗疾病 （ 人工被动免疫 ） 效果显著 。另一种方法是单抗作为
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隆选择并伴 随着后续的克隆扩增 。Ｍ ｉ ｌ ｓ ｔ ｅ ｉ ｎ 和Ｋ ６ ｈ ｌ ｅ ｒ 以克 隆选择学说为理论根据巧妙地提出 以下学说 ：
筛选单克隆抗体的方法
筛选单克隆抗体的方法
单克隆抗体是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的重要
工具。
然而，如何从众多的抗体中筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体一直是一个具有挑战性的问题。
下面介绍几种主要的筛选单克隆抗体的方法。
1. 杂交瘤技术
杂交瘤技术是制备单克隆抗体最常用的方法。
它包括四个主要步骤：免疫动物、细胞融合、筛选和克隆化。
该方法的优点是可以制备高亲和力和特异性较好的单克隆抗体，但其缺点是制备周期长、成本高，且适用范围受到制备抗原的限制。
2. phage display技术
phage display技术是一种通过噬菌体展示抗原表位以筛选单克隆抗体的方法。
在该方法中，抗体基因库被插入到噬菌体表面的蛋白质中，然后通过筛选可以筛选出具有高亲和力和特异性的单克隆抗体。
该方法的优点是速度快、成本低，且可以制备一系列不同抗原的单克隆抗体。
但其缺点是筛选的抗体可能存在亲和力较低或特异性较差的情况。
3. 单细胞PCR技术
单细胞PCR技术是一种通过单个B细胞进行PCR扩增和测序以制备单克隆抗体的方法。
该方法的优点是可以制备高亲和力和特异性较好的单克隆抗体，且可以避免杂交瘤技术中的克隆化步骤，但其缺点是制备周期长、成本高。
总体而言，筛选单克隆抗体的方法有多种，不同方法各有优缺点，选择合适的方法需要根据具体的实验要求进行评估。
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第二节、抗体分子
抗体是具有共同结构和功能形式的一大类糖蛋白。抗体分 成五类：IgG、IgM、IgA、IgE和IgD（见表2-1）。 一、IgG类抗体有两个相同的抗原结合位点 含有抗原结合位点的两个区域被称作 Fab 片段，涉及到免 疫调节的蛋白区称作 Fc 片段，在 Fab 和 Fc 片段之间的部分称 作铰链区。 重链分子量为5.5kDlt；轻链分子量为2.5kDlt。 二、不同类型抗体的区别 IgG、IgM、IgA、IgE和IgD因重链形式不同而有所区别。 它们的重链分别称作γ、μ、α、ε和δ。 重链的不同使这些蛋白具有不同形式的免疫功能，并且在 完成反应成熟的不同阶段发挥作用。这些差异主要是由于 Fc 片段上的蛋白序列不同所致。 轻链只有两种：κ、λ。
一、免疫原性
许多外源分子、病毒或细胞单纯注射在实验动物体内能 引起强的抗体反应，而一些物质却不能，对于这些情况， 常可通过修饰抗原或改变宿主而使免疫系统反应增加。 好的免疫原分子必须具备以下条件： 1、抗原结合于原始B细胞表面抗体分子对于抗体反应是 绝对必要的。这个结合决定了产生抗体的特异性。因为表 面抗体分子上的抗原决定位点与分泌抗体的结合位点是一 致的。 2、它必须能促进B细胞与辅助T细胞间的信息交换。这 要求在两个细胞间有物理连接。即有一个位点被II级蛋白 及T细胞受体所识别。 3、通常它必须可被降解。
体液介导的适应性免疫反应：体液反应引发产生可结合外 来抗原的循环抗体，由B淋巴细胞产生，由辅助T淋巴细胞 介导是抗体技术的基础。 细胞介导的适应性免疫反应：毒性T淋巴细胞结合于外来
或感染的细胞，随后将这些细胞裂解，辅助T细胞参与该反 应。 二、免疫系统能特异性地对无数种分子反应。 免疫系统持续地受无数抗原刺激。免疫系统的一个主要形 式是它能合成大量的抗体及细胞表面受体。各个带有不同抗 原结合位点的抗体和T细胞受体与外来分子的结合提供了免 疫反应特异性的基础。
九、这些重组及其它机制产生了无数的抗原结合位点。 十、等位基因排斥确保在任一 B 细胞中只有重新排列的一 个轻链和一个重链被表达。产生不同重链和轻链的基因重组 不总是产生一个功能基因，在 B 细胞分化过程中，轻链重排 开始于 κ 区内。然后，若二倍体基因中的一个首先重排，产 生一个功能性等位基因，另一个拷贝则进行重组。若二个重 组都产生非功能性等位基因，那么重组就要λ位点开始体， 一个未知的机制就制止进一步重组。将抗原性结合位点固定 ，直到细胞死亡。这个机制叫等位基因排斥。它可以解释为 什么 B 淋巴细胞分泌的只有一种抗原结合位点的抗体和抗体 只有一种类型的轻链。 十一、其它：重组被用于生产各种类和亚类的抗体。
三、抗体轻链的分子结构 比较轻链的氨基酸结构发现，轻链有一个恒定区和一个可 变区。轻链由220个氨基酸组成，分为两个区，每个区由大 约110个氨基酸组成。-NH2末端那半部分是异源性的，称为 可变区（V）；羧基末端那部分称为恒定区（C）。 恒定区有两种类型：一种是决定κ轻链的，另一种是决定 λ 轻链的。 κ 轻链基因位于第 6 染色体上，而 λ 轻链的基因则 位于第16染色体上。 四、抗体重链的分子结构 重链的序列也存在可变区和恒定区（图2-1）。IgG重链含 有一个可变区和三个恒定区，每区含 110个氨基酸，其它重 链含有附加的恒定区。 IgG重链序列也显示γ链有四种亚类，即：IgG1、IgG2a、 IgG2b和IgG3。鼠重链多肽编码区在第12染色体上。
五、重链和轻链的可变区形成抗原结合位点 一个重链的可变区和一个轻链的可变区结合形成一个抗原 结合位点。可变区的异质性提供了动物有效进行免疫反应所 需的无数结合位点的基础。序列异质性并不是由整个可变区 的每一部分决定的，而是集中在与抗原接触的位点上。多数 可变性决定于每一个链的三个短区，它们形成轻链的三个超 变区和重链的三个超变区。这些超变区形成抗原抗体结合的 接触残基的主体，同时这些超变区位于扩展进入抗原反应区 的短环上。由于它们是实际的抗原结合位点，故被认为是互 补决定区。 六、功能性κ、λ轻链和重链基因的一个明显特征是在所有 细胞中这些基因转录后的选择性剪接是不同的（见图 2 ）。 200个V区，4个功能性J区。 七、形成 λ 轻链 pre-mRNA 外显子也要重排（图 3 ）。 V-JC-J-C。 八、形成功能性重链基因需要 pre-mRNA 外显子的重排（ 图4）。50—100种可变区，12个D区，4个J区。
三、个别淋巴细胞识别个别抗原 一个细胞识别一个抗原，因为单一淋巴细胞上的所有抗 原受体是相同的。 在成熟淋巴细胞表面的所有受体都是糖蛋白，体细胞基 因重组、突变及基因转录后加工等使受体产生107个以上的 结合位点。抗原特异性通过确保只有一个类型的受体在一 个细胞内被合成的过程来维持。 虽然B细胞表面抗体和T细胞表面受体都具有类似的结构 ，但它们是由不同的基因家族编码的，其表达具有细胞型 的特异性。B细胞上的表面抗体能结合可溶性抗原，而T细 胞受体仅仅识别在其它细胞表面展示的抗原
四、免疫系统能将外来微生物和分子与自身成分区别开来。 五、系统记忆每一次与外来抗原的遭遇
免疫反应遇到同一抗原时一次比一次强，具有特异性。免 疫记忆可以延续动物终生。
六、免疫反应的许多性质是通过克隆选择确定的
一种抗原活化一种淋巴细胞。当淋巴细胞表面受体结合 抗原时，B淋巴细胞就被活化，分泌抗体被刺激而增殖（急 剧分裂克隆）。 七、一个有效免疫系统的成熟是由广泛的细胞间信息交换来 调节的。
淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体技术
1960年，法国的Barski等首先发现，两种不同类型的细 胞在混合培养的过程中会自发融合形成融合细胞。与此同 时，日本的Okada也发现紫外线灭活的仙台病毒(Sandai virus)可以诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合，在此基础上用灭 活的仙台病毒诱导产生了第一个种间的杂交细胞。 1976年Kohler和Milstein创建了一个方法，他们将分泌一 种特异性抗体的B细胞和体外持续生长的浆细胞瘤融合，产 生的杂交细胞克隆表达了抗体生成的正常B细胞和浆细胞瘤 细胞的免疫球蛋白基因，同时也具有在体外无限增殖的能 力。为此创造了杂交瘤(hybridoma)这个名词，以描述一个 正常抗体生成细胞和一个浆细胞瘤细胞的融合产物。由于 他们的重要科学贡献，Kohler和Milstein在1984年荣获了诺 贝尔医学生理奖。