5.基因组序列的诠释
解读基因组序列
基因功能的计算机分析
➢ 同源性搜索是通过把被研究的DNA序列与数据库 中其他所有的DNA序列进行比较来定位基因。
➢ 同源性搜索的基础是相关的基因具有相似序列， 因此可以通过与不同物种中已测序的同源基因具 有相似性来发现新基因。
▲同源性反映出进化关系
⒈通过基因失活进行功能分析
与表型有关的基因可以通过确定具有突变表型 的生物体中哪个基因是失活的而被鉴别出来。如果 起点是基因而不是表型，那么相应的策略就是进行 基因突变并确定所引起的表型改变，这是大多数用 于确定未知基因功能的技术基础。
⒉同源重组可以使单个基因失活
➢ 使特定基因失活的最简单方法是用一段无关DNA片段 将其破坏（如图5.20） 。这可以通过在基因的染色 体拷贝和另一段与靶基因有一些相同序列的DNA之间 进行同源重组来达到。现在的目的只要知道两个DNA 分子具有相似序列，重组能引起分子片段进行互换 就足够了。
“缺失盒”是含有抗生素抗性的基因，不是酵母基
因组中的正常部分，但如果转入酵母染色体中就会起 作用，就产生一种转化的对抗生素遗传霉素有抗性的 酵母细胞。运用缺失盒之前，新的DNA片段作为尾端连 接到每个末端。这些片段与要被失活的酵母基因的部 分序列相同。当改良盒导入酵母细胞后，同源重组就 在DNA末端和酵母基因的染色体拷贝之间出现，用抗生 素抗性基因代替后者。因此，通过将培养物接种到含 有遗传霉素的琼脂培养基中来筛选携带替换基因的细 胞。所产生的克隆缺少靶基因的活性，可以通过检查 它们的表型获得此基因功能的一些提示。
可进行同源性搜索分析的软件最常用的是BLAST ，只需登陆到该网站的一个DNA数据库中，将序列输 入到在线搜索工具就可以进行分析。标准的BLAST程 序能有效鉴别出序列相似性大于30%~40%的同源基因 。
人类基因组的序列分析
人类基因组的序列分析随着科技的飞速发展，人类基因组的测序也顺利地进行了下来。
人类基因组的序列分析是人类基因研究领域的重要一环，它的实现对于深入了解人的遗传基础、研究人体疾病，有着非常重要的意义。
下文将探讨人类基因组的序列分析。
一、人类基因组的测序历史1990年，人类基因组计划正式启动，旨在对人类基因组进行高通量测序。
整个项目历时13年，于2003年正式完成。
这次人类基因组计划的完成，不仅仅是基因组测序技术的一次飞跃，也是人类基因研究领域的一次重大进展，为生命科学研究开辟了新的局面。
二、人类基因组的序列人类基因组是由双链DNA组成的一个复杂的大型分子，它呈现出高度的复杂性、可变性和异质性。
人类基因组是由大约3.2亿个DNA碱基对组成的。
DNA的中文名称为脱氧核糖核酸，是生命的载体，存放我们的遗传信息。
通过人类基因组的测序可以了解我们生命的基因构成，从而更好地理解我们的生命过程。
三、人类基因组的序列分析是对人类基因组的数据进行处理和分析的过程。
序列分析包括基本的序列处理、注释、比较和功能预测等步骤。
人类基因组的测序完全可以根据它的基本序列信息进行分析，并理解它所揭示的基因结构和生物学功能。
序列分析包括以下几个部分：1. 序列比对序列比对是对不同基因序列进行比较分析，从而确定基因序列间的相似性和差异性。
人类基因组的差异性十分巨大，基因序列间的比对越来越受到关注。
2. 顺式调控元件注释顺式调控元件是影响基因表达的非编码DNA区域，包括启动子、增强子、转录因子结合位点等。
对于人类基因组的功能注释，特别是基因调控方面的研究，对顺式调控元件的分析是十分重要的。
3. 基因预测和注释基因预测是序列分析的一部分，可以对基因的位置、结构和写入从头到尾的信息进行分析。
进而对人类基因的功能和表达机制进行预测。
四、人类基因组的测序技术Sanger方法Sanger法是测序技术的第一代，它是通过在DNA合成反应中加入单核苷otide发生缺失的情况，实现对DNA分子序列的测定。
普通遗传学第十七章基因组(自学)自出试题及答案详解第一套
一、名词解释1、蛋白质工程2、基因组文库3. 多克隆位点4. Southern杂交5. 基因治疗6. 转基因动物7. 显微注射技术8. Klenow片段9. 荧光定量PCR10. 基因芯片11、cDNA文库12、基因枪13. 融合蛋白14. 表达载体15. 限制性核酸内切酶16. Northern杂交17. 逆转录PCR18. 转基因植物19. 体细胞核移植20. DNA改组21、多克隆位点：22、穿梭载体：23. DNA连接酶：24. 核酸分子杂交：25. 融合蛋白：26. 基因敲除：27. 反义核酸技术：28. 荧光定量PCR29. 基因治疗30. 显微注射技术31.基因组DNA文库：32.DNA的复性：33.Tm：34.选择标记基因：35.基因和基因组:36.分子杂交：37.生物技术：38.载体：39.cDNA文库：40.转化:41.黏性末端42.重叠基因：43.基因组文库：44.同尾酶：45.酶切位点二、选择题1、构建cDNA文库时，选用下列哪种载体较好？-------------------------（）①质粒②SV40病毒③Ti质粒④YAC（酵母人工染色体）2、在Northern杂交中，探针主要用什么来进行标记？------------------（）①同位素②EB（溴化乙锭）③染料④DNA3、构建GST蛋白表达系统的载体是为了是目标蛋白以哪种方式表达？-----（）①融合表达②分泌表达③独立表达④包含体表达4、PCR反应中Taq酶常常没有错配碱基纠错功能，因为它没有-----------（）①5’－3’聚合酶活性②5’－3’外切酶活性③3’－5’外切酶活性④3’－5’聚合酶活性5、以下哪种酶需要引物？-----------------------------------------（）①限制性核酸内切酶②末端转移酶③逆转录酶④DNA连接酶6、II型限制性核酸内切酶的切割位点是-----------------------------------------（）①识别序列内②识别序列1000bp以外③识别位点下游24－26bp处④DNA分子任一位点7、Ti质粒中能插入到植物基因组中的DNA区段是-----------------（）①复制远点区②毒素蛋白区③T-DNA区④冠婴碱代谢区8、艾滋病病毒HIV是通过下列哪个基因编码的产物识别人体T淋巴细胞的？-----------------------------------------------------（）①env ②pol ③gag ④LTR9、T4DNA连接酶能催化下列哪种分子相邻的5'端磷酸基团与3'端羟基末端之间形成磷酸二酯键？----------------------------------------------（）①双链DNA ②单链DNA③mRNA ④rRNA10、下列基因中，哪个不能作为基因工程载体的报告基因？---------（）①lacZ ②GFP③Ampr ④ori11、基因治疗的载体采用下列哪种载体比较合适？----------------------（）①逆转录病毒②Ti质粒③噬菌体④质粒pBR32212、采用原核细胞表达系统的优点之一是可以与下面什么过程直接相连-----（）①发酵工程②转基因动物③转基因植物④基因治疗13、以mRNA为模板合成cDNA时，所用的工具酶是-----------------------（）①DNA聚合酶I ②DNA连接酶③逆转录酶④核酸酶14、YAC是----------------------------------------------------------（）①酵母人工染色体②人工Y 染色体③细菌人工染色体④粘粒15、用Sanger双脱氧法进行DNA测序时，凝胶上读出的序列是-------------（）①模板链的②模板链的互补链的③mRNA的④cDNA 的16、同位素标记探针是指在探针上连接----------------------------------（）①32P ②生物素③荧光素④酶17、Southern杂交时，探针与膜上的什么成分杂交？---------------------（）①DNA ②RNA③蛋白质④染色体18、同一种限制性核酸内切酶分别切割目的基因DNA 与载体DNA 时，酶切片段不能互相连接的是------------------------------------------------------（）①目的基因与目的基因之间②载体DNA与载体DNA之间③目的基因与载体DNA之间④目的基因与mRNA之间19、pBR322是一种什么样的载体？---------------------------------（）①粘粒②质粒③噬菌体④人工微小染色体20、PCR引物成对存在，位于目的基因的---------------------------（）①5'端②3'端③C端④N端21、构建CDNA文库时，选用下列哪种载体较好？------------------------------------（）①质粒②SV40病毒③Ti质粒④YAC（酵母人工染色体）22、Northern杂交时，探针与膜上的什么成分杂交？-----------------------------------（）①DNA ②RNA③蛋白质④染色体23、以mRNA为模板合成CDNA时，所用的工具酶是--------------------------------------（）①DNA聚合酶I ②DNA连接酶③逆转录酶④核酸酶24、BAC是-------------------------------------------------------------------------------------（）①酵母人工染色体②人工Y 染色体③细菌人工染色体④粘粒25、用酶促合成法进行DNA测序时，凝胶上读出的序列是-------------------------（）①模板链的②模板链的互补链的③mRNA的④cDNA的26、同位素标记探针是指在探针上连接----------------------------------------（）①32P ②生物素③荧光素④酶27、同一种限制性核酸内切酶分别切割目的基因DNA与载体DNA时，酶切片段不能互相连接的是--------------------------------------------------------------------------------（）①目的基因与目的基因之间②载体DNA与载体DNA之间③目的基因与载体DNA之间④目的基因与mRNA之间28、下列基因中，哪个不能作为基因工程载体的报告基因？----------------（）①lacZ ②GFP③Ampr ④ori29、M13噬菌体是---------------------------------------------------------------------（）①双链噬菌体②单链噬菌体③质粒④粘粒30、常规PCR反应所用到的酶是-------------------------------------------------（）①核酸酶②逆转录酶③DNA连接酶④Taq酶三、填空题1. 世界上成功构建的第一个体外重组DNA分子是在（）年完成的。
基因组编码序列的演化和功能解析
基因组编码序列的演化和功能解析基因组编码序列是指组成基因的DNA序列，它决定了生物的遗传信息和功能。
随着现代生物学的发展，人们对基因组编码序列的研究越来越深入，揭示了它在演化和功能方面的重要性。
一、基因组编码序列的演化1. 同源性分析同源性分析是对基因组编码序列的演化进行研究的重要方法之一。
同源性分析通过比较不同物种之间同一基因的序列，揭示它们之间的演化关系。
比如，通过比较人类和啮齿类动物的CYP2C19基因序列，发现它们在进化过程中发生了很多改变，但它们的同源性非常高。
2. 基因家族基因家族是指在不同物种中拥有共同祖先的基因群体。
基因家族的研究可以揭示不同物种之间的演化关系和共同祖先的特征。
比如，人类和兔子拥有共同祖先的免疫球蛋白基因家族，这些基因在免疫系统和疾病防御中发挥重要作用。
3. 基因转移基因转移是指基因在不同物种之间的转移和共享。
基因转移的研究可以揭示不同物种之间基因功能的相似性和差异性。
比如，青色花卉中的花青素基因在不同物种之间发生了基因转移，这些基因在花色的决定中发挥着重要作用。
二、基因组编码序列的功能解析1. 基因的识别和注释基因的识别和注释是对基因组编码序列进行功能解析的关键步骤。
通过从基因组编码序列中识别出基因，并分析其编码的蛋白质或RNA分子的结构和功能，可以理解基因组编码序列的功能。
比如，人类基因组计划的研究，揭示了人类基因组中的约20000个基因，其中一部分编码的蛋白质在人类生命过程中的调节和控制中发挥着重要作用。
2. 基因的表达和调控基因的表达和调控是基因组编码序列的重要功能之一。
通过研究基因的表达和调控，可以深入理解基因组编码序列在生命过程中的作用和调控机制。
比如，人类基因组中的一些基因，通过调节和控制其表达水平，在人类疾病的发生和进展中发挥着重要作用。
3. 基因的进化和功能创新基因的进化和功能创新是基因组编码序列中的重要功能之一。
通过研究基因的进化和功能创新，可以理解基因组编码序列的演化和功能创新机制。
基因组序列 mrna序列 cdna序列
基因组序列、mRNA序列和cDNA序列在生物学和分子生物学研究中扮演着重要的角色。
它们对于揭示生物体内基因表达和调控机制、研究遗传变异和发育过程等方面具有重要意义。
本文将从基因组序列、mRNA序列和cDNA序列的概念、特点、应用等方面进行详细介绍和阐述。
一、基因组序列1. 概念：基因组序列指的是一个生物体细胞中所有染色体的DNA序列的总和。
它涵盖了生物体的全部遗传信息，包括基因、非编码区域等。
2. 特点：基因组序列具有较大的长度和复杂性，不同生物体的基因组序列差异较大。
人类基因组序列长度约为3亿个碱基对，而小鼠基因组序列长度约为2.5亿个碱基对。
3. 应用：基因组序列的测定对于揭示生物体的基因组结构、功能基因的定位、比较基因组学的研究等具有重要意义。
通过基因组序列的分析，可以帮助人们更好地理解生物体的遗传信息和遗传变异。
二、mRNA序列1. 概念：mRNA（信使RNA）是基因转录的产物，它携带着从基因组上转录出来的遗传信息，作为蛋白质合成的模板。
mRNA序列即为mRNA分子上碱基的排列顺序。
2. 特点：mRNA序列通常较为稳定，其长度取决于所对应的基因的长度。
mRNA序列中含有丰富的遗传信息，包括编码信息和非编码信息。
3. 应用：mRNA序列的测定对于研究基因的表达水平、寻找新的蛋白编码基因、研究基因调控机制等具有重要意义。
通过mRNA序列的分析，可以帮助人们更好地理解基因表达和调控的机制。
三、cDNA序列1. 概念：cDNA（互补DNA）是以mRNA为模板，通过逆转录酶将mRNA转录成DNA的过程所得到的DNA分子。
cDNA序列即为cDNA分子上碱基的排列顺序。
2. 特点：cDNA序列通常比mRNA序列短，因为cDNA只包括了基因的编码区域，不含有非编码区域。
cDNA序列反映了基因的表达情况。
3. 应用：cDNA序列的测定对于研究基因的克隆、基因的表达和调控、寻找新的蛋白编码基因等具有重要意义。
第5章基因组序列诠释
基因注释的方法
1. 目前基因注释的方法主要依赖于生物信息学方 面的分析结论,它们包括以下自动注释内容: 1) ab inition 软件的预测, 依据基因结构的特点. 2) 同源性比较 3) 基序(motif)或功能域(domain)分析预测基因 功能.
4) 相似性(similarity)系指同源蛋白质的氨基酸顺序中一 致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例. 可取代氨基酸 系指具有相同性质如极性氨基酸或非极性氨基酸的成 员, 它们之间的代换不影响蛋白质(或酶)的生物学功能.
相似性与一致性
249 MFN-MAI PFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG 232 I LTSL TLPFS AGAYAQALNQQQTTV I S - -T S GS 注: 红色为一致性氨基酸, 蓝色为可取代氨基酸, 白色为趋
人类基因的命名规则(2)
5) 和已知基因重叠并由反义链编码的基因，如IGF2AS，insulinlike growth factor 2, antisense (类胰岛素生长因子2反义 基因)。
6) 可转录但不翻译却具功能的DNA片段，如XIST， X (inactive)specific transcript (X染色体专一性失活转录物)。
3) 基因注释的软件通常容易犯误拼和误拆的错误, 即将 两个基因归在一个, 或者反过来.
4) 容易遗漏很小的外显子, 特别是保守性不强的基因.
5) 容易忽略小基因.
6) 无法预测mRNA中5’-和3-’非翻译区(UTR), 即很难确 定转录起点与终点.
不同注释软件比较
1) 目前基因组注释的软件绝大多数都是根据已 有基因结构的数据编写的,具有很多的经验成 分.
解读基因组序列
非编码区变异功能影响预测
基于转录因子结合位点的预测方法
通过分析非编码区变异对转录因子结合位点的影响，预测变异对基因表达 调控的影响。这种方法可以识别出与特定转录因子相关的关键变异。
基于长非编码RNA的预测方法
研究长非编码RNA在基因组中的功能和调控机制，分析非编码区变异对长 非编码RNA结构和功能的影响，进而预测变异对基因表达和表型的影响。
个性化医疗和精准医学发展前景
个体化治疗方案
01
基于基因组序列的解读，医生可以为患者制定个性化的治疗方
案，选择最适合的药物和剂量，提高治疗效果。
精准预防策略
02
通过分析基因组序列，可以预测个体对某些疾病的易感性，从
而制定针对性的预防措施，降低患病风险。
遗传咨询与生育指导
03
解读基因组序列可以为遗传咨询提供科学依据，帮助家庭了解
基于表观遗传学修饰的预测方法
研究表观遗传学修饰在基因组中的分布和功能，分析非编码区变异对表观 遗传学修饰的影响，进而预测变异对基因表达和细胞命运的影响。
实验验证方法介绍
01
基因编辑技术
利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术，在细胞或个体水平上对特定基因进
行精确编辑，引入或修复变异，观察表型变化以验证变异的功能影响。
基于比对算法的SV检测方法
通过比对算法识别待测序列与参考序列之间存在大 片段的插入、缺失、倒位或易位等结构变异。
基于组装算法的SV检测 方法
利用组装算法对基因组序列进行组装，通过 比较组装结果与参考序列的差异来检测结构 变异。
05
解读基因组序列：功能影 响预测与验证
变异对蛋白质功能影响预测
基于序列比对的预测方法
02
基因组序列诠释辽宁师范大学PPT课件
②绝大多数基因含有非编码的内含子。高等真核生 物多数外显子的长度少于100个密码子，有些不到50 个密码子甚至更少，因此当读码进入内含子时很快 遇上终止密码，难以根据上述的ORF长度来判断哪 种读框是正确的。
内含子的出现给计算机判读基因带来不少问题，在编写ORF扫描 程序时要作许多修改，必须加入一些相应的规则：
采用RACE方法可获得丢失的cDNA序，可采用cDNA末端快速扩增技术 (rapid amplification of cDNA end，RACE)方法寻找 这些丢失的末端顺序。根据残缺cDNA内部顺序先合 成一对引物，将mRNA环化后使其与引物复性，再经 PCR扩增。扩增产物再用第二对巢式引物PCR放大 ，可获得mRNA 5’-和3’-端顺序。
① 当某一基因的转录产物进行可变剪接时，由于连接 的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带。此外， 如果该基因是某一多基因家族的成员，也会出现多个信 号。这两种现象要设计其他实验进一步区分。
② 基因的表达具有组织专一性及发育阶段的差别，选 择的RNA样品有时不一定含有该基因的产物。因此要 尽可能多地收集各种发育时期及不同组织器官RNA， 以免因人为原因而遗漏。
5.1.2 实验分析确认基因
任何基因都可转录为RNA拷贝，这是实验确证基因 的依据。真核生物中许多编码蛋白质的基因其转录 的初级产物都有内含子，加工后成为mRNA。根据 mRNA的顺序可以找到外显子的位置以及整个基因 的组成。由于mRNA的5’端及3’端各有一段非翻译区， 基因的转录起点与终点有时并不准确，但不妨碍整 个基因的界定。
③ 不同基因的表达产物丰度差异很大，对低拷贝的 表达产物要适当提高RNA的上样量。有些基因表达 产物丰度极低，或表达时期短暂不易提取，此时要考 虑其他检测方法。例如可根据已知的DNA顺序设计 引物从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探 针与之杂交，这一方法称为拟northern分析。
第5章_基因组序列
●一对酵母的端粒序列
●选择标记 ●克隆位点
高分 子量 DNA
TEL
AmpR ARS1 EcoRI ori TRP1 CEN4 URA3
TEL
EcoRI部分消化 分子量标准 （kb）
EcoRI酶切 EcoRI EcoRI
500 400 300 200
分离400-500 kb的DNA片段
连接
100
PFGE
酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 线虫 (Caenorhabditis elegans) 果蝇 (Drosophila melanogater) 鼠 (Mus musculus) 人类 (Homo sapiens)
拟南芥（Arabidopsis thaliana） 玉米 (Zea mays) 番茄 (Lycopersicon esculentum) 大麦 (Hordeum vulgare) 水稻 (Oryza sativa) 火炬松 (Pinus taeda)
一个方向不断变换
的电场取代单向电场， 使电泳中受阻的DNA 分子在电场改变时扭 转迁移方向，小分子
DNA比大分子DNA更
易在凝胶中重新定向， 因而迁移速度更快， 脉冲场凝胶电泳的原理
达到分离大分子DNA
的目的。
(2) DNA片段的克隆载体
所有的克隆载体都包括三种共同的组成部分，即复制 基因（replicator）、选择性标记和克隆位点。 选择载体系统时，主要考虑克隆DNA片段的大小。 质粒（plasmid）: 5 kb
不同生物基因组中每厘摩的物理距离存在很大
的差异。遗传距离与物理距离的这种关系，反映了
通过遗传作图对基因物理定位的精度。该比率
（Kb/cM，单位遗传距离的碱基数）越小，基因物
生物信息学中的基因组序列分析
生物信息学中的基因组序列分析介绍生物信息学中的基因组序列分析近年来，随着基因组学的发展和应用，生物信息学逐渐崭露头角。
基因组序列分析则是生物信息学中的一大领域，为什么这么说呢？因为基因组序列分析可以让我们更全面地了解生物体内基因片段的分布，从而推动生物学的研究，发现更多的疾病基因，为疾病治疗提供更多的策略和方向。
一、基因组序列分析的重要性基因组是生物体内所有DNA序列的总和，其中包括编码蛋白质的基因和不编码的DNA序列。
事实上，基因组中的编码蛋白质的基因只占总基因数的不到2%，而其余的基因则包括RNA基因、调控元件以及其他功能未知的序列。
对其中的细微变化进行推理和分析，不仅有助于深入理解基因组的演化过程，更能为生物医学研究提供理论基础。
二、基因组序列数据的获取与处理在基因组序列分析时，基因组序列数据的获取和处理必不可少。
目前，常用的数据获取方式主要包括测序、转录组数据以及其他生物数据。
而在数据处理上，则主要涉及测序数据去重、配对、质量控制、拼接和碱基质量评估等。
三、基因组序列分析的方法在基因组序列分析中，由于基因组序列的复杂性和巨大性，需要使用一些方法和工具帮助我们更好地掌握和分析序列信息。
以下将介绍基因组序列分析中常见的方法。
1. 基因预测法基因预测法是从基因组序列中寻找潜在的编码序列或序列域的过程，该方法可以分为组学方法和算法方法，也可以分为homology based和de novo based方法。
其中homology-based方法主要是从已知序列中推断新序列的编码信息，而de novo-based方法则主要是从基因组序列中直接寻找编码信息。
2. 基因组比较法基因组比较法是将不同基因组序列进行比较，寻找两个或两个以上特定基因组之间的共同点和差异。
该方法广泛应用于比较不同种类之间、不同组之间以及不同环境下同一物种的基因组序列，从而深入了解基因组演化和生物多样性。
3. 基因表达分析法基因表达分析法是研究生物体内基因表达的一种方法，通过对基因组中编码蛋白质的基因进行表达分析，可以深入了解基因之间的相互作用关系，及其在生命活动中的作用。
基因组测序
基因组测序 序列的组装 基因序列的诠释
第1节 DNA测序的基本方法
链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
一、 链终止法测序 (the chain termination method)
（一）基本原理
1977年Sanger提出了“终止法”。反应体系 包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶， 分四组进行，每组按一定比例加入一种2 ’ ,3’双脱 氧核苷三磷酸，它能随机掺入合成的DNA链，一 旦掺入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端 核苷酸必定为该核苷酸，经变性胶电泳，可从自显 影图谱上直接读出DNA序列。
利用基因芯片进行杂交测序的原理
第2节 DNA序列的组装
定向测序 随机测序与序列组装
一、 定向测序策略
定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺 序进行分析 。
传统方法 新方法
1、传统方法
传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确 定小片段的排列顺序，然后将小片段克隆进载 体进行测序和序列分析。
A 克隆于质粒中DNA
DNA克隆到质粒载体中 碱变性或煮沸变性为单链DNA 缺点：有细菌DNA或RNA可能作为假模板或引物
B M13克隆单链DNA
M13 噬菌体颗粒是丝状的，基因组为单链 DNA，在 宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA（正链）在 宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA，用于DNA的 复制，因此这种双链DNA 称为复制型 DNA 。感染宿 主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬 菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。
（二）技术路线
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
5.基因组序列的诠释
基因剔除(knock-out)
基因敲除
最简便的基因失活的方法. 1987年建立， 2007年获诺贝尔生理医学奖 主要原理: 在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基 因两侧相同的序列, 导入目的细胞,由于同源片段 之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色 体中. 为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报 告基因
7
Kozak规则: 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1, 2 , 3位， 侧翼碱基序列具有以下特征：
第4位的偏好碱基为G
ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基
8
B 信号肽分析
A B C D E F G H I 起始密码子 ATG 信号肽分析 终止密码子 3’端的确认 非编码序列、内含子 密码子偏爱性 外显子－内含子边界 上游调控序列 软件预测
6
根据开放读码框(ORF)预测基因
A 起始密码子 ATG
第一个ATG的确定(依据Kozak规则) Kozak规则--基于已知数据的统计结果 第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统 计规律
33
基因失活
基因剔除（knock-out） 反义RNA技术 RNAi技术
转座子插入突变
34
5.2 基因功能的测定
基因剔除（knock-out） 最简单的基因失活方法，用一段无关的 DNA片段取代目标基因。
主要原理：用一段无关的核苷酸序列取代目
标基因的中间序列，导入生物体内或目的细 胞内，如果该基因所控制的表型发生变化， 即从反面验证了目标基因的功能。
基因的序列分析
基因的序列分析基因是生命体中的基本单位，控制着生物体的发育、生长和繁殖等过程。
通过对基因序列的分析，可以有效了解这些基本单位的功能和变化，从而为生命科学的研究和相关应用提供基础支持。
本文主要介绍基因的序列分析，包括基本概念、主要方法和相关应用等方面，以期为读者提供一些参考和启示。
基因序列的基本概念基因序列是指一条由核苷酸（DNA或RNA）组成的线性序列，是表达基因信息的物质基础。
天然基因序列通常以ATCG（DNA）或AUCG（RNA）四种字母作为基本单元，组成一些特定的字符串，例如“ATGACAAGCTTCTCAGTCAAGG”就代表了一个简单的DNA序列。
基因序列的长度可以非常巨大，微生物基因有数百个核苷酸，而人类基因的长度则通常在数万个核苷酸到数百万个核苷酸之间。
基因序列可以分为编码区和非编码区，其中编码区包含了编码蛋白质的基因的信息，而非编码区则包含了调节元件、基因启动子、转录因子结合位点等信息。
基因序列的分析方法直观分析法最原始、最简单的基因序列分析方法，是通过人工直接查看基因序列，了解其中蕴含的信息。
这种方法最常用于微生物遗传学研究中，早期的遗传学家利用这种方法，解析了许多微生物路径方式和代谢途径的信息。
但是这种方法存在着许多缺陷，例如需要繁琐耗时地逐个查看碱基，对于长度较长的基因序列来说，不仅容易犯错，而且很难发现潜在的模式和规律。
计算机分析法随着计算机科学的发展，基因序列的计算机分析方法也得到了广泛应用。
为了更好地描述基因序列，科研工作者将碱基序列转换为字符串，并进行序列分析和比对。
目前，计算机分析方法主要包括序列比对、序列聚类、序列模式识别等几个方面，具体如下：1.序列比对分析序列比对分析是将不同物种的基因序列进行比对，找出两方之间的相似点和差异点。
一方面可以为进化分析和生物系统学研究提供基础支持，另一方面还可以通过比对得到基因的同源模板序列和保守区域序列等信息。
2.序列聚类分析序列聚类分析是将基因序列进行分类，并划分出相互关系紧密、同源性大的序列群。
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F 密码子偏爱性
同义密码：编码同一氨基酸的不同密码子， 差别在于密码子的第3位碱基 不同种属间使用同义密码的频率有很大差异， 如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为 GCA、GCC、GCT, GCG很少使用 种属特征性密码子序列在编码区出现，非编 码区只保持平均的碱基分布水平
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根据序列分析搜寻基因
A B C D E F G H I 起始密码子 ATG 信号肽分析 终止密码子 3’端的确认 非编码序列、内含子 密码子偏爱性 外显子－内含子边界 上游调控序列 软件预测
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根据开放读码框(ORF)预测基因
A 起始密码子 ATG
第一个ATG的确定(依据Kozak规则) Kozak规则--基于已知数据的统计结果 第一个ATG侧翼序列的碱基分布所的亚群进一步筛选 cDNA均一化：抑制高拷贝cDNA，增加低拷贝
cDNA数量。DNA复性动力学
合适条件下，多数高拷贝cDNA呈双链，中低拷 贝cDNA呈单链 羟基磷灰石柱吸附双链cDNA 收集单链cDNA
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5’RACE (CLONTECH) 中英联合实验室
G 外显子－内含子边界
外显子和内含子的边界有明显的特征 内含子的5‘端或称供体位（donor site）常 见的顺序为 5’ -AG↓GTTAAGT-3’ 3’端又称受体位（acceptor site)，多为 5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’ (Py：嘧啶核苷 酸，T或C)
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1.基因失活
基因的功能实现--一个过程，从基因到表型的一 系列生理生化反应过程 正向遗传学：传统的遗传分析，从表型出发最 终到达基因 反向遗传学：现代基因功能研究方法，与传统 遗传分析相反，从基因出发，最终到达表型 基因组计划中基因功能研究：基因到表型。通 过系列实验方法鉴别与目标基因相关的表型 基因失活是基因功能分析的主要手段
5 基因组序列的诠释
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问 题
基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？ 基因组作为一个整体如何行使其功能？ 用什么方法寻找基因、研究基因的功能？
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基因组序列的诠释
研究基因组的最终目的--诠释基因组所包含的 信息和基因组功能。
1. 在基因组中搜寻基因 根据序列分析搜寻基因 实验分析确认基因
①建立生物模型。 基因功能、代谢途径等研究中模型生物的建立非常 重要。基因敲除技术建立某种特定基因缺失的生物 模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞 ，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的 是小鼠，家兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因 敲除模型也常见于报道。 ②疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。 通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研 究它对机体的影响。对于了解疾病的根源、寻找基 因治疗的靶目标都有重大意义。
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D 3’端的确认
Poly(A)尾序列 若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根 据加尾信号序列“AATAAA”，与 BLAST同源性比较结果共同判断
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E 非编码序列、内含子
高等真核生物多数外显子长度 少于100 个密码子，有的不到50个 密码子甚至更少
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特定生物基因组的特有组成-- CpG岛，脊椎动物基因组 许多基因的上游promotor都有，长度1kb，GC比例高
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I 软件预测
采用NCBI的ORF预测软件 ( ORF finder: /gorf/orfig.c
gi )判断ORF的可能范围
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5.1 在基因组中搜寻基因
如何获取基因全长cDNA序列？确定其在cDNA序列的测序、对比，以及与基 因组DNA的比较，确定基因所在的区域；通过物 种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；
中验室
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C 终止密码子
终止密码子: TAA, TAG,TGA
GC% = 50% 终止密码子每 64 bp出现一次
GC% > 50% 终止密码子每100－200 bp 出现一次 由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可 能的选择应该是 ORF 不少于100 个密码子
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3’RACE (CLONTECH) 中英联合实验室
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5.2 基因功能的测定
一. 利用计算机分析基因功能 二. 实验分析确定基因功能
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一.利用计算机分析基因功能
同源性确定基因功能
同源基因都拥有一个共同的祖先基因，有许 多相似序列。同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因（orthologous gene）： 不同物种之间的同源基因，来自物种分化以前的 共同祖先 种内同源基因或平行基因（paralogous gene） 同一物种内的同源基因，常常是多基因家族的不 同成员。其共同祖先可能存在于物种形成以后， 也可能存在于物种形成之前
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基因敲除基本步骤
ES细胞的获得 基因载体的构建
目的基因导入筛选靶细胞Biblioteka 观察生物学性状的改变
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tk 胸苷激酶标记基因 ← gangcyclovir neor 新霉素抗性基因→G418
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基因敲除技术的应用及前景：
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5.1 在基因组中搜寻基因
高等真核生物DNA的ORF的阅读障碍： 基因间存在大量非编码序列（人类基 因组占70%） 很多基因含有内含子 由于多数外显子长度<100个密码子， 当读码进入到内含子时很快就遇到终 止密码，从而难以判断读码的准确性
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5.1 在基因组中搜寻基因
2. 基因功能测定
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5.1 在基因组中搜寻基因
ORF（opening reading frames）扫描：人工或计算机 序列筛选
ORF：每个编码蛋白的基因都含有ORF，由一系列密 码子组成，通常以ATG开始，TAA、TGA、TAG结束。 通过寻找起始密码子和终止密码子确定ORF序列，是 寻找基因的一种重要的方法 成功关键：终止子在DNA序列中出现的频率。
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H 上游调控序列
几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，与 DNA结合蛋白作用，控制基因表达 原核生物调控序列有明显特点，参考 真核生物
基因上游控制序列差异较大 通过同源性比较来预测mRNA的5’端 真核启动子数据库(The TRADAT Project , Eukaryotic Promoter Database, EPD. http://www.epd.unil.ch/ )
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基因剔除(knock-out)
基因敲除
最简便的基因失活的方法. 1987年建立， 2007年获诺贝尔生理医学奖 主要原理: 在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基 因两侧相同的序列, 导入目的细胞,由于同源片段 之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色 体中. 为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报 告基因
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Kozak规则: 若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1, 2 , 3位， 侧翼碱基序列具有以下特征：
第4位的偏好碱基为G
ATG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T 在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基 除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基
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同源性分析在酵母基因组计划中的应用
酵母基因组大约含有6000个基因， 30％--通过传统遗传学分析得到
70％--通过同源性分析获得
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5.2 基因功能的测定
二. 实验分析确定基因功能
基因失活 基因超表达 噬菌体展示 （phage display） 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
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基因失活
基因剔除（knock-out） 反义RNA技术 RNAi技术
转座子插入突变
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5.2 基因功能的测定
基因剔除（knock-out） 最简单的基因失活方法，用一段无关的 DNA片段取代目标基因。
主要原理：用一段无关的核苷酸序列取代目
标基因的中间序列，导入生物体内或目的细 胞内，如果该基因所控制的表型发生变化， 即从反面验证了目标基因的功能。
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5.1 在基因组中搜寻基因
DNA序列中基因位置的确定
分子杂交可以判断DNA片段中是否含有基因，但 不能给出基因定位信息 cDNA测序：获得基因定位信英联合实验室
cDNA测序受两个方面的影响：
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B 信号肽分析
信号肽分析软件(SignalP) http://www.cbs.dtu.dk/services/signalP 把预测过程中证实含完整mRNA 5’端的序 列翻译为蛋白序列 然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列 (从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始) 进行评估，如果SignalP分析给出正面结果， 则测试序列有可能为信号肽