扩张床分离 吴慎剑

细胞悬浮液具有以下的特点
目标产物浓度普遍比较低； 组分非常复杂，是含有细胞、细胞碎片、蛋白
质、核酸、脂类、糖类和无机盐类等多种物质 的混合物； 产物易失活，性质不稳定，易被空气氧化、易 受微生物污染、易被蛋白酶水解
二、扩张床的吸附原理
发酵液内含有大量的颗粒，这些颗粒要在进行 层析前除去。目前除去固体颗粒最常用的方法 是离心和过滤。
Streamline扩张床吸附剂
基质
苯基
阴离子
阳离子
强化阴 离子
染料亲 和
蛋白A亲 和
一一 一一 一一 一一 一一 一一
一 一 一 十 一 十十十
十十 十 一 一 十
十十十
一一 一一 一 一 一一 一一
十十 十十
十 十 十十 十十十
一一
一一 一一 一一 一一 一一 一一
亲和力种类：静电引力；疏水性作用。 危害：1.使吸附剂发生聚集
扩张床方式洗脱是缓冲液从扩张床底部 泵入，进行向上洗脱。
优点：①洗脱方式简单，洗脱迅速；② 可减少返压；③不会造成吸附剂颗粒的 聚集，提高清洗效率；④洗脱设备简单； ⑤可实现连续化生产。
5)清洗
包括吸附剂的再生(Regeneration)和扩张床 的消毒(Sanitization)。
再生是维持吸附剂的吸附能力和确保所有杂质 都被清除的必要环节
4)洗脱 固床方式洗脱是缓冲液从扩张床顶泵入，以
固定床方式向下洗脱； 优点：减少洗脱缓冲液的用量，增加产物浓度，
减少残留在床内的细胞对产物的污染， 缺点：①洗脱时间比较长，洗脱操作复杂，需
要调节高度调节器和反向进样；②操作时膨胀 介质会产生聚集，影响其再度膨胀，造成在位 清洗的困难；③床层压降高，对介质的机械强 度要求高。
离心和过滤工艺的缺点： 1.步骤多，累积损失大； 2.操作时间长，目标产物易失活； 3.对微米以下的颗粒，特别是对细胞碎片很难有
效除去； 4.投入高速离心机和超滤设备，增加了生产成本。
离心、过滤： 步骤多，累积损失 大，操作时间长， 目标产物易失活， 对微米以下的颗粒 难除去，设备成本 高。
相当于一个平衡 级，效率差
3)冲洗 目的：除去床层间滞留的细胞和细胞碎片；除去非结
合或弱结合性的可溶杂蛋白。
除去颗粒杂质冲洗时，流向与吸附时相同，采用的流 体开始时大多使用平衡缓冲液。整个冲洗过程一般需 要5～20倍沉降床体积的缓冲液。
洗涤液的黏度或密度较低，会使床层不稳定。用25％ 甘油溶液洗涤，效果较好，由于其黏度和密度较大， 洗涤液呈活塞流，能有效地将细胞颗粒洗出而对床层 的稳定性无影响。流出液中观测不到固体杂质时可继 续保持扩张床方式，也可改用固定床方式，因为采用 扩张床流体速度限制在最小流化和夹带速度之间，固 定床的低速不受限制，此时缓冲液流向取决于操作方 式。注意调节上部速率分布器的位置比床层上界面高 出0.5～1.0 cm。
几个概念
1.最低流化速度 ：料液自下向上运动，当达到某一速度 时，床层开始扩展，称为最低流化速度
2.终点沉降速度：床层继续随流速的增大而不断扩张， 吸附剂间隙增大，悬浮颗粒能通过，吸附剂仍能保持 不被带出的最大流速
3.床层空隙率：扩张床高度与沉降高度之比。
三、扩张床吸附基质特性要求
吸附剂的尺寸和密度应保证其终端流速与料液中需除 去的固形颗粒间有明显的差异；
2.破坏扩张床的稳定分级结构 3.削弱分离效果 4.床层的崩溃
评价方法 ：生物颗粒静态吸附法、生物颗粒 脉冲响应法和停留时间分布(RTD)分析法。
①生物颗粒静态吸附法： ②生物颗粒脉冲响应法。 ③RTD分析法。
扩散系数——表示气体（或固体）扩散程度的物理量。 扩散系数是指当浓度为一个单位时,单位时间内通过 单位面积的气体量。
多孔玻璃
130-250
密度/(g/mL) 1.15 1.3 3.7 1.32
1.3-1.5 1.35 1.2 2.2
表观液体流速(cm/min) 3.0 4.3 2.5 8.8 13.3 8.0 10.8 4.0
3.扩张床吸附基质的制备
(1)共混包埋法 将增重微粒均匀分散在天然亲水性高分
子溶液中，通过溶解、结晶、再生等手 段得到多孔基质。琼脂糖和纤维素都存 在明显的链聚集结晶区域，结晶再生时 能形成稳定的多孔网络结构，并能将增 重材料包埋其中。
在设计过程中，应该考虑把生物颗粒的影响引入到扩 张床的过程设计中，在过程开发的早起就同时兼顾“目标 物的吸附”和“生物颗粒顺吸附剂互相作用”，及时发现 并排除生物颗粒的负面影响，确保扩张床吸附过程的顺利 实施。
生物颗粒在不同吸附剂表面的吸附
生物颗粒
面包酵母 面包酵母匀浆液 大肠杆菌 大肠杆菌匀浆液 葡萄球菌 杂交瘤细胞
扩张床分离
汇报人：吴慎剑 日 期：2012.11.7
扩张床吸附技术
概述 扩张床的吸附原理 扩张床吸附基质及装置 细胞及碎片对吸附剂性能的影响 扩张床 操作 扩张床 吸附存在的问题及前景
一、概述
它集过滤、浓缩和初步纯化于一步完成，减少了操作 步骤，缩短了操作时间，能提高收率和降低成本。
扩张床吸附技术已广泛应用于包涵体、 胞内、围膜、胞外分泌；酵母菌、动物 细胞、杂交瘤、昆虫细胞等表达的重组 生物产品的纯化，亦被应用于动植物组 织、果汁、动物乳汁以及其它一些微生 物中目标产物的提取，也可将扩张床用 作生物反应器和生物物质的检测装置， 其分离规模也正从中试向工业化方向发 展
7.扩张床吸附存在的问题
返混严重
平推流，空隙率 大，压降小，吸 附剂利用率高
空隙小，易造成堵 塞，床层压降增大
平推流是理想状态下在流动方向上完全没有返混，而在垂直于流动方向的平面 上达到最大程度的混合。
上图是全混釜、流化床、扩张床和固定床的
操作模式的比较。其中全混釜上料液处于理想 混合时，只相当于一个平衡级，其效率比固定 床差。一般液固相分离主要采取固定床方式， 料液流经装有层析介质的柱时在介质层中流动 基本上呈平推流，返混小，柱效高。但当料液 中含有固体颗粒时，由于介质问的空隙很小， 颗粒滞留在介质间，造成堵塞，床层的压降增 大，最终使吸附无法进行，所以采用这种层析 方法之前必须对原料液进行固液分离。
如将含纤维素的黄原胶溶液与含微米级TiO2颗 粒的水溶液共混，升温溶解，然后在甲醇溶液 中再生，即得到混合型的基质，但由于机械强 度不够，需要进行后交联反应增强基质的强度。 由于基质是经过研磨后筛分而得，形状并不一 致，这会影响扩张时的流体力学特性。另外， TiO2微粒随机分散在纤维素骨架的网络结构中， 也会影响蛋白质分子的传质效果。
物理、化学性质的方法。
2.共聚物改性
4.扩张床吸附装置
基本结构与固定床一样 上下分布器要求：分布器只
能让流体垂直向上流过 ；剪 应力控制在最小的范同内， 以防止产物变性 ；细胞或细 胞碎片不易滞留；方便清洗 。 吸附柱设计 要求：减小液相 返混程度
5.细胞及碎片对吸附剂性能的 影响及评价
研究表明，若细胞或细胞碎片等生物颗粒吸附在介 质上，将严重影响介质对目标物的吸附。下表列出了一些 生物颗粒在不同吸附介质表面的吸附情况，可见主要是静 电力在起作用。
(2)反相悬浮聚合法
采用反相悬浮聚合法将亲水性的不锈钢、二氧
化钛、二氧化锆等增重内核或微核包埋在亲水 性的天然高分子骨架中。例如使用石蜡油作分 散相、Span85作乳化剂，将不锈钢微珠分散 在琼脂糖的水溶液中，控制搅拌速度以获得不 同的琼脂糖厚度，逐步降温冷却可获得高密度 核壳型基质。如果在水相中加入交联剂(如环 氧氯丙烷)，则可实现反相悬浮交联，基质的 强度进一步提高，而孔隙率并不受到明显的影 响。
发酵液或培养液的体积大、黏度高，故处理难、费时 多，常使目标蛋白质受到蛋白酶、糖苷酶的作用而被 破坏。故第一步操作常常成为整个下游过程的制约步 骤。
扩张床吸附技术是一种集成化分离技术，即对已有的 两种单元操作进行有效的组合，组成一种更有效的单 元操作，以达到提高产品收率，缩短纯化步骤，降低 纯化费用和投资成本的目的。
吸附剂必须有一定的粒径和密度分布，在扩张床中会 形成稳定的分级，从而减小固液相问的返混；
吸附剂应具有良好的孔道结构，不易被料液中的脂类、 核酸和杂蛋白等生物物质污染；
吸附剂应具有特异性吸附的配基，使吸附剂对目标产 物具有较高的吸附容量；
吸附剂应具有较高的化学稳定性和良好的机械强度， 其中较高的化学稳定性可以保证吸附剂可以承受较苛 刻的洗脱条件，而良好的机械强度可延长吸附剂的使 用寿命；
吸附剂应具有良好的传质性能，在较高的流速下，可 以保持较高的吸附量。
商品化的扩张床/流化床介质
介质名称
直径/um
琼脂糖-石英
100-300
琼脂糖-金属
80-165
琼脂糖-不锈钢
20-40
琼脂糖-硅藻土
200-450
琼脂糖-玻璃
100-300
葡聚糖-二氧化硅 100-300
纤维素-二氧化钛 125-600
(3)悬浮聚合法
将增重用的亲水性不锈钢、二氧化钛等无机 物进行表面改性处理，利用悬浮聚合将其包埋 于高分子共聚物中。由于共聚的单体是有机亲 油性的，而增重剂都是无机亲水性的，两者相 溶性较差，聚合过程中易发生相分离，对增重 剂有机化表面改性的效果直接决定了能否较大 地提高颗粒的密度。
(4)表面改性法 1.化学改性：通过化学反应改变聚合物的
杂质的危害：降低介质的吸附容量，特别是反 复使用的介质，严重时还会导致吸附剂的集聚， 出现沟流，影响扩张床的混合特性
6)扩张床吸附技术的应用
小分子
链霉素发酵液的不过滤直接用离子交换分离提取，其 分离过程是链霉素发酵结束后仅先酸化后中和，而不 过滤除去菌丝及固形物，直接从交换柱的下部，以表 观流速115～146 cm·h叫送入柱中进行吸附，含菌丝 及固形物的残液从柱上部流}H，待穿透后切断进料， 用清水逆洗，将滞留的菌体和固形物等杂质除净，然 后用稀硫酸洗脱并分段收集洗出液送去精制，离子交 换柱则用酸和碱再生。扩张床过程将固液分离、吸附、 浓缩集成在一起，大大简化了操作步骤，并使链霉素 的收率大幅度地提高