蛋白质下游纯化工艺简介
蛋白质纯化知识详解
蛋白质纯化知识详解一、蛋白纯化原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。
一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。
粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽，并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。
精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。
仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。
二、纯化程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。
1、前处理分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。
为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。
然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。
动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。
细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。
下游蛋白纯化工艺表征
下游蛋白纯化工艺表征
《下游蛋白纯化工艺表征》
蛋白质是生命体内重要的组成部分，对于理解生物学过程和研究疾病机制具有重要意义。
下游蛋白纯化是指从其它生物组织或者表达系统中得到目标蛋白，并进行纯化、浓缩和表征的过程。
蛋白质纯化的目的是从复杂的混合物中分离目标蛋白，并去除其它杂质。
在下游蛋白纯化的过程中，为了分离目标蛋白，常采用多种不同的分离方法，如柱层析、电泳等。
其中最常用的是亲和层析，通过配体选择性地结合目标蛋白，实现其分离。
其他分离技术还包括离子交换层析、凝胶过滤层析、逆流层析等。
在完成纯化过程后，需要对得到的目标蛋白进行表征，以验证其纯度和活性。
蛋白质表征的目标包括性质和功能特征等。
性质表征包括分子量、等电点、氨基酸组成等，常用的方法有
SDS-PAGE、2D电泳等。
功能表征则包括酶活性、结合性等，可以通过酶活性测定和配体结
合实验等方法进行。
蛋白质表征的过程中，还需要根据需要进行一些附加的处理和分析。
例如，可以采用Western blotting来检测目标蛋白的免疫反应性，并进行定量分析。
此外，还可以利用质谱技术对目标
蛋白进行序列分析，以确定其组分和修饰。
总之，下游蛋白纯化工艺表征是蛋白研究中的重要环节，为了获得高纯度、活性的目标蛋白，需要灵活运用各种纯化技术和表征方法。
通过精确的纯化和表征过程，能够为蛋白质研究提供准确可靠的基础。
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化工艺蛋白质纯化工艺是一种将混合物中的蛋白质分离和纯化的过程。
蛋白质在生物科学和生物技术领域有着广泛的应用，因此蛋白质纯化工艺的研究和开发具有重要的意义。
蛋白质纯化的目的是从复杂的生物样品中分离出所需的蛋白质，并去除其他杂质。
在蛋白质纯化过程中，常用的方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、透析等。
离子交换是一种常用的蛋白质纯化方法，它基于蛋白质和离子交换树脂之间的相互作用。
树脂上的固定离子与溶液中的离子相互吸附，从而实现蛋白质的分离和纯化。
离子交换方法通常分为阳离子交换和阴离子交换两种。
阳离子交换树脂选择性地吸附带有负电荷的蛋白质，而阴离子交换树脂则选择性地吸附带有正电荷的蛋白质。
凝胶过滤是一种基于蛋白质的分子大小和形状差异进行纯化的方法。
凝胶过滤方法通过将混合物通过一系列孔径不同的凝胶材料，使大分子蛋白质被滞留，而小分子溶质则通过凝胶。
这种方法适用于分离不同分子量的蛋白质。
亲和层析是一种利用蛋白质与特定配体之间的亲和力进行纯化的方法。
亲和层析方法可以利用蛋白质与金属离子、抗体、配体等之间的特异性相互作用，实现蛋白质的选择性吸附和纯化。
亲和层析方法具有选择性强、纯化效果好的优点，因此在蛋白质纯化中得到广泛应用。
透析是一种通过溶液中的溶质浓度梯度来实现溶质扩散的方法。
在蛋白质纯化中，透析方法常常用于去除溶液中的低分子量杂质，如盐和小分子有机物。
透析方法的基本原理是将蛋白质溶液与含有较低浓度的缓冲液分隔开，通过半透膜的渗透作用，使溶液中的小分子杂质扩散到缓冲液中，从而实现蛋白质的纯化。
除了上述常用的蛋白质纯化方法外，还有许多其他方法，如亲水交换色谱、逆流电泳、等电点聚焦等。
这些方法的选择取决于所需纯化的蛋白质特性、目标纯化程度和纯化效率等因素。
蛋白质纯化工艺是一项重要的生物技术工作，通过合理选择和组合不同的纯化方法，可以实现对复杂混合物中蛋白质的高效分离和纯化。
蛋白质纯化工艺的研究和应用将为生物科学研究和生物技术开发提供有力支持，也将为蛋白质相关领域的进一步发展带来新的机遇和挑战。
蛋白质分离纯化设计
蛋白质分离纯化设计1. 简介蛋白质分离纯化是一项重要的实验技术，在生物医药、食品科学、农业等领域有着广泛的应用。
通过对蛋白质进行分离纯化，可以获得单一纯度的蛋白质用于后续研究及应用。
本文将详细介绍蛋白质分离纯化的设计方法和常用技术，包括样品准备、分离方法选择、纯化步骤设计等。
同时，我们还将讨论常见的挑战和解决方案，以及如何评估分离纯化效果。
2. 样品准备在进行蛋白质分离纯化前，首先需要准备好样品。
样品的选择和准备对于后续分离纯化过程非常重要。
2.1 选择合适的样品样品可以来自细胞、组织、体液、培养基等。
在选择样品时，需要考虑到蛋白质的种类、表达水平、目标纯化程度以及后续实验需要。
2.2 样品预处理样品在分离纯化前需要进行预处理，以去除可能干扰纯化过程的杂质。
常用的预处理方法包括细胞破碎、离心、除去非蛋白质成分等。
预处理方法的选择应根据样品类型和后续纯化方法进行优化。
3. 分离方法选择根据蛋白质分离的原理和样品特性，我们可以选择合适的分离方法。
常见的分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤、透析、亲和层析等。
3.1 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质带电性质的分离方法。
可以根据蛋白质的以阴离子或阳离子带电来选择合适的离子交换树脂，实现不同蛋白质的分离纯化。
3.2 凝胶过滤凝胶过滤是一种基于蛋白质大小的分离方法。
通过选择适当的孔径大小的凝胶，可以分离不同分子大小的蛋白质。
3.3 透析透析是一种基于蛋白质分子量和溶液成分的分离方法。
通过选择适当的膜材料和透析缓冲溶液，可以实现蛋白质与小分子化合物的分离。
3.4 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合来分离纯化的方法。
选择合适的亲和配体，可以选择性地结合目标蛋白质，从而实现其分离纯化。
4. 纯化步骤设计在选择合适的分离方法后，需要设计纯化步骤来实现目标蛋白质的分离和纯化。
纯化步骤的设计应根据分离方法的特点和目标蛋白质的性质进行优化。
4.1 样品加载将预处理的样品通过适当的装载方式加载到分离纯化柱中，如使用注射器将样品缓慢注入。
蛋白纯化技术简介
在固定相和流动相之间经过多次分配以不同的速率移
动，从而达到分离的目的。
蛋白质层析技术
Company Logo
蛋白质层析技术
Company Logo
❖ 层析技术基本原理
1. 吸附层析
混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相 对不同物质的吸附力不同而使混合物得到分离。
增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子有效的亲 和结合。
Company Logo
Company Logo
2. 凝胶介质的种类
小结
Company Logo
（＊数字越小，表示介质交
（1）葡聚糖凝胶（Sephadex ） G-数字 联度越大，分级范围越小。）
凝
胶 过
（2）琼脂糖凝胶
①Sepharose（2B,4B,6B） ②Sepharose CL（2B,4B,6B） ③Superose (6,12)
蛋白质纯化技术
Company Logo
蛋白质纯化技术
Company Logo
蛋白质纯化技术
Company Logo
❖ 切向流过滤
切向流过滤（Tangential Flow Filtration ，简称TFF）
其概念是相对于常规过滤（Normal Flow Filtration ， 简称NFF ）而言的。
Sepharose 6 Fast Flow
分离颗粒 范围大小
特性/应用
Company Logo
pH 稳定性
耐压 最高流速
（Mpa） (cm/h)
Sepharose 4 Fast Flow
蛋白质层析技术
Company Logo
❖Sepharose CL
大肠杆菌发酵蛋白的下游工艺
大肠杆菌发酵蛋白的下游工艺哎呀，说起大肠杆菌发酵蛋白的下游工艺，这可真是个技术活儿，得慢慢来，一步步来。
首先得说，这大肠杆菌，别看它小，可真是个蛋白质生产的好手。
不过，从发酵罐里出来的蛋白，那可不能直接用，得经过一系列的下游工艺处理，才能变成我们想要的纯净蛋白。
首先，咱们得把发酵液给收集起来。
这发酵液里头，除了我们想要的蛋白，还有一大堆乱七八糟的东西，比如细胞碎片、代谢废物等等。
所以，第一步就是得把这些杂质给去掉。
这通常得用到离心或者过滤的方法。
想象一下，就像你用筛子筛面粉，把大颗粒的杂质筛掉，留下细腻的面粉一样。
接下来，就是纯化了。
这一步，得用到一些高级的玩意儿，比如层析技术。
这层析技术，就像是给蛋白质过筛子，不过这筛子可高级多了，能根据蛋白质的大小、电荷等等特性，把不同的蛋白质分开。
这过程，就像是你在超市里挑水果，根据大小、颜色，把好的挑出来，坏的扔掉。
然后，就是浓缩和干燥了。
这一步，得把纯化后的蛋白质给浓缩，减少水分，这样蛋白质才能更好地保存和运输。
这过程，有点像你把果汁榨出来后，用火慢慢煮，把水分蒸发掉，留下浓缩的果汁。
最后，就是质量控制了。
这一步，得确保我们得到的蛋白质是纯净的，没有杂质，也没有被污染。
这得用到一些检测技术，比如质谱、电泳等等。
这就像是你买完菜后，还得检查一下，看看有没有坏的，有没有农药残留。
你看，这大肠杆菌发酵蛋白的下游工艺，虽然听起来挺复杂的，但其实每一步都有它的道理。
就像做饭一样，从洗菜、切菜、炒菜，到最后的装盘，每一步都不能少，这样才能做出一道色香味俱全的好菜。
同样，这蛋白的下游工艺，也是为了保证我们最后得到的蛋白，是纯净、安全、有效的。
虽然过程繁琐，但为了得到高质量的蛋白，这些步骤都是必不可少的。
蛋白质的纯化的方法及原理
蛋白质的纯化的方法及原理蛋白质的纯化是从其来源中去除其他有机物和无机物，使其成为纯净的蛋白质样品的过程。
蛋白质纯化的方法可以根据需要选择，其中常用的方法包括盐析、凝胶过滤、电泳、金属柱层析、亲和层析、离子交换层析、逆相高效液相色谱等。
下面将详细介绍这些方法及其原理。
一、盐析盐析是利用不同浓度的盐溶液对蛋白质溶液进行逐渐稀释，从而使蛋白质发生沉淀的过程。
纯化蛋白质的关键是利用蛋白质与溶剂中离子之间的相互作用来控制蛋白质的溶解和沉淀过程。
在盐析中，通过选择离子强度和种类可以调整蛋白质溶液中所需溶剂化离子的浓度，达到沉淀和纯化蛋白质的目的。
二、凝胶过滤凝胶过滤是一种分子筛分离方法，利用不同孔径的凝胶进行分离。
凝胶的孔径能够排除较大分子，如核酸和细胞碎片，而较小分子，如蛋白质则能通过孔隙，实现纯化。
该方法简单易行，不需要任何特殊设备，适用于中小分子量的蛋白质纯化。
三、电泳电泳是利用蛋白质在电场中的移动性差异进行分离和纯化的方法。
常用的电泳方法有平板电泳、SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）和Western blotting （免疫印迹法）等。
电泳能够根据蛋白质的电荷、分子大小和不同的电场力，在凝胶中分离蛋白质，使其形成带状。
通过切割所需蛋白质的带状区域，可以实现对目标蛋白质的纯化。
四、金属柱层析金属柱层析是利用金属离子与蛋白质之间的亲和性进行分离的方法。
金属柱通常被配制成金属离子亲和基质，并固定在柱子上。
目标蛋白质通过与金属离子发生亲和作用而被保留在柱中，其他杂质则从柱中流出。
通过调节洗脱缓冲液的离子浓度和pH值，可实现对目标蛋白质的纯化。
五、亲和层析亲和层析是利用配体与其特异性结合的蛋白质进行分离和纯化的方法。
通常将配体固定在柱子上，待蛋白质样品通过柱子时，目标蛋白质与配体结合，其他杂质则流失。
通过改变洗脱缓冲液的条件，如离子浓度、pH值和络合剂的添加，可以实现目标蛋白质的纯化。
六、离子交换层析离子交换层析是一种利用蛋白质与离子交换基质之间的相互作用进行分离和纯化的方法。
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法
蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
是当代生物产业当中的核心技术。
该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。
常用技术有：１、沉淀，２、电泳：蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动。
根据支撑物不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。
３、透析：利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
４、层析：a.离子交换层析，利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。
如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛，又称凝胶过滤。
小分子蛋白质进入孔内，滞留时间长，大分子蛋白质不能时入孔内而径直流出。
５、超速离心：既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。
不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
蛋白质分离纯化技术蛋白质的分离纯化一、沉淀法沉淀法也称溶解度法。
其纯化生命大分子物质的基本原理是根据各种物质的结构差异性来改变溶液的某些性质，进而导致有效成分的溶解度发生变化。
1、盐析法盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升，但当盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间互相凝聚并从溶液中析出。
2、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有二：其一、与盐溶液一样具有脱水作用；其二、有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小。
3、蛋白质沉淀剂蛋白质沉淀剂仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用，常见的有碱性蛋白质、凝集素和重金属等。
4、聚乙二醇沉淀作用聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。
5、选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。
蛋白质分离纯化过程每一步的细化介绍
蛋白质分离纯化过程每一步的细化介绍蛋白质是生物体内最重要的大分子有机化合物之一，它在维持生命活动、调节代谢以及构建细胞结构方面发挥着重要作用。
然而，在生物体内蛋白质的复杂性和多样性使其分离纯化过程变得困难。
为了获得纯度较高的蛋白质样品，科学家们开展了一系列细致入微的步骤。
蛋白质分离纯化的第一步通常是细胞破碎。
细胞破碎可以通过物理方法（如超声波破碎或高压破碎）或化学方法（如细胞裂解酶的作用）来实现。
这一步骤的目的是将细胞膜破坏并释放出细胞内的蛋白质。
接下来，需要进行蛋白质的初步分离。
这一步骤通常采用离心技术，通过不同蛋白质的相对分子质量和沉降速率的差异来实现。
离心可以将细胞碎片、细胞器和其他杂质与目标蛋白质分离开来。
离心的条件可以根据样品的特性进行调整，以达到最佳的分离效果。
在初步分离后，需要进行更加精确的分离和纯化步骤。
这一步骤通常采用各种色谱技术，如凝胶过滤、离子交换、亲和层析和逆流色谱等。
这些技术基于蛋白质的不同性质，如大小、电荷、亲和性等，来实现蛋白质的分离。
通过不断调节色谱条件，可以逐步提高蛋白质的纯度。
需要对获得的纯化蛋白质进行检测和鉴定。
常用的检测方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、质谱分析和免疫学方法等。
这些方法可以确定蛋白质的分子量、组成成分以及可能存在的杂质。
通过综合分析这些结果，可以确定蛋白质的纯度和活性。
总的来说，蛋白质分离纯化的过程是一个复杂而细致的过程，需要一系列的步骤来实现。
通过细胞破碎、离心、色谱分离以及检测鉴定等步骤，可以逐步提高蛋白质的纯度，并获得高质量的蛋白质样品。
这些纯化蛋白质样品在生物医学研究和药物开发领域具有重要的应用价值。
蛋白纯化技术简介课件
蛋白纯化技术简介课件CATALOGUE目录•蛋白纯化技术概述•蛋白纯化技术方法•蛋白纯化步骤与流程•蛋白纯化技术挑战与解决方案•蛋白纯化技术展望与发展趋势•蛋白纯化技术案例分析CATALOGUE蛋白纯化技术概述蛋白纯化目的蛋白纯化的定义与目的各种方法基于不同的物理或化学原理，如电荷分布、分子大小、特异性结合等，实现对蛋白质的分离与纯化。
蛋白纯化技术的分类与原理原理分类蛋白纯化技术的应用领域01020304生物化学研究临床诊断制药工业食品工业CATALOGUE蛋白纯化技术方法应用盐析法在蛋白纯化中应用广泛，适用于大多数蛋白质的纯化。
原理盐析法主要是利用蛋白质在低盐浓度时溶解度降低，高盐浓度时溶解度升高的特性，通过在中间盐浓度时加热或静置，使溶解度降低的蛋白质析出。
优缺点盐析法操作简单，成本低，但有时会造成蛋白质的变性，影响其生物活性。
盐析法原理凝胶色谱法主要用于蛋白质分子量的分离和纯化。
应用优缺点原理应用优缺点030201原理应用优缺点电泳法原理应用优缺点膜分离法CATALOGUE蛋白纯化步骤与流程初步分离缓冲液置换细胞破碎粗分离阶段03疏水相互作用色谱01亲和色谱02离子交换色谱精细分离阶段质谱分析HPLC分析SDS-PAGE电泳纯度检测与鉴定阶段CATALOGUE蛋白纯化技术挑战与解决方案1 2 3亲和色谱法离子交换色谱法凝胶过滤色谱法杂蛋白的去除选择合适的纯化方法根据蛋白的性质和纯化要求，选择适合的纯化方法，以尽可能提高目标蛋白的回收率。
优化实验条件对实验条件进行优化，如pH值、温度、离子强度等，以提高目标蛋白的回收率。
多次纯化将纯化过程分为多个步骤，每个步骤针对不同的杂质进行去除，从而提高目标蛋白的回收率。
目标蛋白的回收率添加保护剂避免剧烈操作低温操作蛋白的稳定性与活性保持CATALOGUE蛋白纯化技术展望与发展趋势纳米材料新型介质新材料与技术的发展集成化自动化集成化与自动化技术进步生物药物研发蛋白纯化技术在生物药物研发中具有重要作用。
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化是各种生物分子的重要技术，主要用于研究分子的结构，功能，互作等。
蛋白质纯化的过程主要包括以下几个步骤：
一、获得材料:
研究需要蛋白质的纯化，可以从细胞培养或动物身上提取出所需的蛋白质，同时也可以从其他属于同一物种的蛋白质中获得纯化蛋白质。
二、酶消解:
酶消解是将蛋白质破坏成多种小分子，从而使蛋白质的结构变化，减少其在某一步骤中的阻碍。
一般可以使用酶来实现蛋白质的消解，由于消解过程中会减少蛋白质的稳定性，因此需要在消解时注意控制温度以及酶的浓度，以避免蛋白质发生不可逆变化。
三、离心纯化:
将消解后的蛋白质通过离心操作进行纯化，根据蛋白质的不同，可以选择不同的离心方法，例如沉淀等方法，以进行细胞蛋白质的纯化，或者采用柱离心的方法，使细胞内的大分子分离出来。
四、提取和再纯化:
离心纯化后，可以采用溶剂提取的方法，对离心纯化的蛋白质进行纯化，同时也可以进行二次纯化，以提高蛋白质的纯度。
五、测定活性:
对纯化的蛋白质进行活性测定，可以检查蛋白质的活性是否达到所需要求，以此来评估蛋白质纯化的效果。
蛋白质纯化是一个复杂的过程，需要仔细设计，以保障蛋白质的纯度，确保实验的效果。
细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程__概述及解释说明
细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述细胞培养法重组蛋白生产是一种常用的生物技术手段，可以通过调控细胞代谢过程来大规模制造特定蛋白质。
这种技术在医药、农业、工业等领域都有广泛应用，为我们提供了丰富的蛋白质资源。
然而，在实际应用过程中，要保证高产量和纯度的蛋白质产出并不容易，因此需要建立完善的上下游工艺流程以及有效的控制策略。
1.2 文章结构本文将从引言开始，逐步深入介绍细胞培养法重组蛋白生产的上下游工艺流程及其相关要点。
首先，在第二节中，我们会详细讨论细胞培养步骤以及蛋白表达和分泌过程。
然后，在第三节中，我们会重点关注收获和破碎细胞的步骤以及蛋白纯化和精制过程。
接着，在第四节中，我们将讨论实施中可能遇到的挑战并提出解决方案。
最后，在第五节中，我们将总结重要观点、结果和发现，并给出未来的展望和建议。
1.3 目的本文的目的是为读者提供一份详尽且清晰的细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程的概述以及相关解释说明。
通过深入了解每个步骤的原理和关键要点，读者将能够更好地理解这种生产方法，并在实际操作中拥有更高的成功率。
我们希望该文可以为相关领域的研究人员、工程师和学生提供有价值的参考，从而推动细胞培养法重组蛋白生产技术在各个领域的进一步应用和发展。
2. 细胞培养法重组蛋白生产上下游工艺流程2.1 细胞培养步骤：在细胞培养法中，重组蛋白的生产需要经历一系列的步骤。
首先，需要选择适合的宿主细胞进行培养。
常用的宿主细胞包括大肠杆菌（E. coli）、哺乳动物细胞等。
然后，将目标基因导入宿主细胞中，并通过合适的启动子和调控元件来实现基因的表达。
接下来是对宿主细胞进行预处理，包括建立种子库、优化培养基和培养条件等。
种子库是为了确保有足够数量和活力的宿主细胞可供后续扩展使用。
针对不同类型的宿主细胞，对培养基成分和配方进行优化可以提高蛋白表达效率和产量。
在进入正式培养阶段之前还需要进行预培养步骤，以使得宿主细胞适应新的环境并增加生长速度。
蛋白质纯化工艺
蛋白质纯化工艺蛋白质纯化是生物工程学重要的研究和应用基础。
蛋白质纯化包括质量和生物活性的筛选，在各种体系中短暂的保存与防止变性与失活，滤纯，再分离，活性评价，最后进行其化学组成分析和蛋白质结构分析等。
蛋白质纯化技术是分子生物学研究和药物开发的重要步骤，也是生物活性物质的制备技术，其正确的应用将决定检测或研究的成败。
蛋白质纯化工艺主要包括以下步骤：粗纯化、活性筛选、精纯化、储存保护、测定纯度、稳定性研究、活性评价、结构分析及分子变异研究等。
1、粗纯化粗纯化是蛋白质纯化的第一步，是从复杂的细胞、组织和体液等中分离出质量较高的蛋白质的步骤。
精确的粗纯化是实际纯化步骤的关键，可以减少后面精纯的步骤数量，从而减少纯化的时间和成本，提高纯化效率。
粗纯化的能否实现良好极大程度上取决于蛋白质的组成，它的特性密切相关于技术的选择，一般采用分离技术和催化材料结合在一起，以便相容性的反应释放蛋白质。
2、活性筛选活性筛选是一种重要的技术，它可提供有关活性的相关信息，重要的是评估蛋白质的生物活性，这 requires a complex set of assays to identify and understand the activity of a protein. 常用的活性筛选技术有：ELISA(酶联免疫吸附测定)、流式细胞术(FACS)、定量PCR(qPCR)、酶联免疫检测(ELISPOT)、荧光免疫检测(FITC)、定量蛋白印迹(WB)、定量琼脂糖凝胶电泳(SDS-PAGE)、RNA 组学(RNA-Seq)和细胞形态学等。
3、精纯化精纯化是蛋白质纯化工艺中最重要的一步，它是将有效的活性蛋白质从其它杂质物质中分离出来的过程，其基本步骤有：蛋白质浓缩、抽提、沉淀、结合、柱层析、交换性结合、膜分离、离心等。
精纯化的方法实际上也是一种分离技术，它是利用物理性质的差异分离和抽提蛋白质，包含了层析法和属性法两种分离方式。
生物工程下游纯化的工艺流程
生物工程下游纯化的工艺流程一、什么是生物工程下游纯化。
咱们先来说说这生物工程下游纯化是啥。
简单来讲呀，就像是从一堆混合的宝贝里挑出最最纯正的那一个。
在生物工程里呢，上游过程得到的产物是个大杂烩，有我们想要的目标产物，还有好多其他的东西，就像你去菜市场买菜，你想要的是新鲜的西红柿，可是筐子里还有烂叶子、小虫子啥的。
下游纯化就是把那些烂叶子、小虫子都去掉，只留下西红柿的过程，只不过这里的“西红柿”是我们生物工程里的目标产物，像蛋白质、酶之类的东西。
二、粗分离阶段。
1. 离心。
这是纯化流程里很重要的一步哦。
你可以想象一下，就像洗衣机甩干衣服一样。
把混合的东西放在离心机里一转，那些比较重的杂质就像沙子一样沉到底下了，而我们要的目标产物就会相对集中在上面的溶液里。
这一步就像是初步的筛选，把那些特别明显的大块杂质先给弄走。
不过这时候溶液里还是有不少其他的小杂质的呢。
2. 过滤。
过滤就像是个小筛子。
大的颗粒杂质就被这个筛子挡住了，只有小分子的东西和我们的目标产物能通过。
这个筛子有很多种，有的筛子孔大一点，有的小一点。
就像我们淘米的时候，刚开始用手把那些大石头块、稻壳之类的大东西挑出去，然后再用细一点的筛子把一些小沙子筛掉。
在生物工程里也是这样，不同的过滤方式能去掉不同大小的杂质呢。
三、精细纯化阶段。
1. 层析。
层析这东西可神奇啦。
它就像是一个有很多小房间的大楼。
我们把混合的东西送进去，不同的物质就会根据自己的特性，比如大小啊、电荷啊之类的，跑到不同的小房间里。
就像一群小朋友去游乐场玩，有的小朋友喜欢玩旋转木马，就去了那个区域，有的小朋友喜欢玩滑梯，就去了滑梯那边。
我们的目标产物就会被集中在某几个特定的“小房间”里，这样就和其他杂质分开啦。
这里面又有好多种层析方法呢，像离子交换层析，就是根据物质的电荷不同来分离的；凝胶过滤层析则是根据分子大小来分的。
2. 亲和层析。
这可是个很厉害的纯化方法哦。
它就像是用磁铁去吸铁屑一样。
蛋白质纯化方法及原理
蛋白质纯化方法及原理
蛋白质纯化是一种技术，它将一种特定的蛋白质从其他物质中分离出来，使其达到一定的纯度。
蛋白质纯化的技术有很多种，它们的原理也有所不同。
其中，最常用的纯化技术是电泳分离技术，它可以利用电场的力将蛋白质和其他物质分开，从而实现蛋白质的纯化。
电泳分离技术的原理是，在电场作用下，蛋白质和其他物质形成质子流，由于质子流的原因，蛋白质会在电场中运动，而其他物质则会沿着电场而不动。
由于蛋白质和其他物质的不同性质，电场的作用使它们在电泳液中分开，从而达到纯化蛋白质的目的。
另外，蛋白质纯化也可以利用离子交换技术来实现。
离子交换技术是利用离子交换柱上的离子交换树脂，将蛋白质与其他物质分离的技术。
当蛋白质溶液通过离子交换柱时，蛋白质会被离子交换树脂吸附，而其他物质不会被吸附，从而实现蛋白质的纯化。
此外，蛋白质纯化也可以采用硅胶凝胶柱技术来实现。
硅胶凝胶柱技术是通过利用蛋白质与硅胶凝胶之间的相互作用，将蛋白质与其他物质分离的技术。
当蛋白质溶液通过硅胶凝胶柱时，蛋白质会被硅胶凝胶柱吸附，而其他物质不会被吸附，从而实现蛋白质的纯化。
蛋白质纯化的技术有很多，上述介绍的只是其中三种最常用的技术，
其原理也不尽相同。
不同的技术需要不同的条件，但它们都是通过利用蛋白质与其他物质之间的性质差异，来实现蛋白质的纯化。
基因工程的下游技术重组蛋白的表达、纯化和分析
2. 亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出 口封闭。加入少量的无离子水，排去下端 的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶 4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成 糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝 胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和 凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为 45mL。
3. 1#：接50μL空载工程菌（含pUC18）过夜培 养物，25-28℃培养10 h-12h； 2# ：接 50μL 重组菌（含 pGFPuv ）过夜培养 物，25-28℃培养10 h-12h； 3#：接50μL重组菌（含pGFPuv ）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后加入20%葡萄糖50μL至终浓度为0.2%， 及100mM IPTG 5μL至终浓度为0.1mM，2528℃培养8h-10h或过夜； 6#：接500μL重组菌（含pGFPuv）过夜培养 物， 37℃培养至 O.D600 约为 0.5 （约 3h-4h) ， 然后只加入 100mM IPTG 50μL 至终浓度为 0.1 mM，25-28℃培养8h-10h或过夜。
一．实验目的 了解和掌握IPTG诱导表达的原理。 了解降解物阻遏的现象及其机理。
二．实验原理
操纵子是基因表达的协调单位。通常由2 个以上功能相关的结构基因以及一些调节 序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。
乳糖操纵子由三个结构基因 Z 、 Y 、 A 和 操纵序列、启动子、 CAP 结合位点等调 节序列组成。
四．实验仪器
超净工作台、 恒温摇床、离心机等。
五．操作步骤 1. 挑取含pUC18质粒工程菌及含pGFPuv质 粒工程菌单菌落，分别接种于含氨苄青霉 （终浓度为100μg/mL，以下同)的5mL的 LB培养基中，于37℃、250rpm过夜培养 12h-14h至对数生长期。 2. 取 3 支已灭菌的大试管，分别加入 5mL 含 有氨苄青霉素的 LB 培养液，编号为 1# ， 2#，3#，另取一个250mL的灭菌三角瓶， 编号为6#，加入50mL含氨苄青霉素的 LB 培养液。
蛋白的分离纯化详细讲解
变性和复性
• 原理：蛋白质在一定的理化条件下失 去原有的空间结构、生物学功能及部 分理化特性等称为变性.当变性条件去 除后恢复原有的空间结构及生物学功 能即为复性.
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯化 原核表达蛋白
二、蛋白质的分离纯化
分离纯化流程
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上,使之 固定化,就有可能分离纯化专一作用tag <6-8 Histidine>镍离子-6
个组蛋白 T7-tag <MASMTGGQQMG> HSV-tag <QPELAPEDPED> S-tag <KETAAKFERQHMDS> VSV-G-tag <TTDIEMNRLGK> HA-tag <YPYDVPDYA>
一、蛋白质的分离纯化概述
与蛋白质分离纯化相关的理化特
• 分子大小
性
• 分子形状
哪些技术、原理
• 带电特性
• 溶解特性
• 与配体特异性结合不同
• 吸附性质
• 变性和复性
分子大小 重点
• 大小：蛋白质的分子大小主要取决于蛋白 质肽链的数目及每条肽链的氨基酸残基数 目.
• 常用方法 • 透析 • 超滤 • 凝胶过滤 • 离心
离蛋白质混合物最强大的技术,也是蛋白质组学研究的重要技术.
• 基本步骤：第一相等电聚焦后,在等电聚焦的垂直的方向进行第二
相SDS-PAGE.
双向凝胶电泳的原理：第一向基于蛋白质的等电点不 同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDSPAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面 上分开.
蛋白质下游纯化工艺简介
蛋⽩质下游纯化⼯艺简介蛋⽩质下游纯化⼯艺简介Downstream（下游）与上游相对的概念，⼀般⽽⾔，上游指基因克隆、细胞培养等⽬的产物表达⼯序，下游指从表达有⽬的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的⽬的产物的⼀系列步骤。
美、⽇、欧等发达国家⽣物技术产品⼯业化的实践证明：⽣物技术产品的产业化⾼度依赖于基因⼯程下游⼯序技术及设备的进步。
⼀、纯化⼯艺常⽤衔接技术：1、盐析。
常采⽤硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(<-20℃)中可以长期保存。
2、等电点沉淀。
根据蛋⽩质、多肽在等电点时溶解度最⼩的特点进⾏。
3、有机溶剂沉淀。
采⽤冷的丙酮、⼄醇沉淀蛋⽩质。
例如⼈⾎浆蛋⽩的⼄醇分级沉淀。
4、透析。
根据⽬的蛋⽩质、多肽的分⼦量，选取适宜的透析袋进⾏透析，可以起到更换缓冲液以及去除⼀些低分⼦杂质的⽬的。
5、超滤。
根据⽬的蛋⽩质、多肽的分⼦量，选取适宜截留分⼦量(MWcutoff)的超滤膜进⾏超滤。
6、真空冷冻⼲燥。
利⽤在低温和⾼真空条件下，冰不经融化为液态⽔⽽直接升华为⽔蒸⽓的原理。
可以很好地浓缩样品和保存蛋⽩质、多肽的⽣物活性。
7、变性沉淀。
根据⽬的蛋⽩质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较⾼的温度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的⽅法。
例如胸腺肽制备中使⽤的热变性(~80℃)去除杂蛋⽩。
如果⽬的蛋⽩、多肽本⾝热稳定性、酸碱稳定性不⾼则不宜采⽤。
8、离⼼沉淀。
利⽤离⼼沉降⼒将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采⽤⾼速冷冻离⼼机进⾏。
9、脱盐。
透析、超滤可⽤于进⾏脱盐，SephadexG25、G50常⽤于蛋⽩质脱盐。
10、过滤澄清过滤、除菌过滤（微⽶膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）⼆、蛋⽩质、多肽液相⾊谱纯化⽅法简介chromatography，⾊谱，层析表1常⽤的液相⾊谱纯化⽅法及其原理1、纯化的⼀般⽬标和⽅法⾸先，⾃然来源或者重组表达的蛋⽩质经过⼀些粗提的步骤（例如：匀浆、离⼼、硫酸铵沉淀等）成为稳定的可以⽤于⾊谱分离的样品。
生物制药下游纯化技术概述
生物制药下游纯化技术概述生物技术通过微生物和细胞培养的使用，是高价值产品的主要来源，且目前制药行业已可大规模地生产，用于不同疾病的治疗。
但无论是通过植物、动物组织、微生物或细胞培养生产，所需的产物通常会存在于相当复杂的料液流体中，需要大量的纯化过程。
所以，在生物科技行业，下游处理部门的生物化学家和化学工程师面临着诸多的挑战。
他们一般在研发阶段使用不同的实验室规模纯化方法，然后再将工艺放大至生产规模，且方法必需经济、高效、快速，以加快产品上市时间。
在生物性产品的工业化生产过程中，由于产品来源以及产品本身的差异，其下游工艺会有很大的差异，所以，每种工艺都必需根据产品的特性及其收获或纯化来源而“量体裁衣”。
本文将简单介绍下游工艺不同阶段所使用的常规技术。
❶发酵液收获下游工艺的第一步是从发酵液中分离生物质。
于细胞内表达的目的蛋白通常为可溶性蛋白，但有些情况下也可能是不溶性的包涵体。
生物质回收常采用制备型离心方法，但现在更倾向于使用有不同孔径选择的切向流过滤系统，孔径规格包括0.2、0.45及0.65μm。
处理时，需选择合适的孔径，以防止处理液中的微粒会进入膜孔，导致滤液流速的显著降低，也通过调节工艺条件控制这一现象，获得优化的进样、滤液流速以及跨膜压。
发酵液的组成会显著影响滤液流速，比如用于控制发酵过程中起泡现象的消泡剂，这种疏水性化合物会快速吸附到膜表面，导致通量降低。
在特定的工艺条件下，某些消泡剂还会从溶液中析出，形成不溶性的微粒，堵塞膜孔。
所以，在选择发酵工艺的消泡剂时，必需考虑到后续步骤。
在细胞收获过程中，通过向细胞浓缩液中补加合适的溶液，即可对细胞进行漂洗（洗滤），该过程也可维持细胞悬液所需的pH或离子强度，避免细胞裂解。
洗滤也可以去除工艺料液中的可溶性杂质。
该步骤通常在细胞浓缩达到特定值而通量迅速降低时进行。
❷细胞裂解及裂解液澄清收获的细胞团块可在高压条件下进行机械破碎，释放所需的产物以进行进一步的处理。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质下游纯化工艺简介Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。
美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
123456、7pH89、脱盐。
透析、超滤可用于进行脱盐，Sephadex G25、G50常用于蛋白质脱盐。
10、过滤澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介chromatography，色谱，层析表1 常用的液相色谱纯化方法及其原理2、纯化前的准备工作（1）样品稳定性试验a、测定样品在pH 2-9的稳定性；b、测定样品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸铵中的稳定性；c、测定样品在0-50%乙醇、甲醇中的稳定性；d、测定样品在4-40℃的稳定性；e、室温下静置过夜，测定对蛋白水解酶的稳定性。
（2）样品预处理a、去除样品中颗粒物（0.45-0.22微米膜过滤或者10000 g离心15分钟）由于不同的色谱方法的原理不同，其对样品的要求也不相同，所以必须在进行色谱之前，根据特定色谱方法的要求对样品进行进一步的处理。
如下表所示：表3 不同色谱方法对于样品的要求a、避免接近或超过样品的稳定极限防止蛋白质变性或沉淀b、在密闭容器中冰箱冷藏较长期储存（数天）a、b、同上c、加入适当的抑菌剂长期储存a、同上b、冰冻或者最好冻干（真空冷冻干燥）保存。
3、对每一纯化步骤的评价相关方法的建立a、目的蛋白含量测定bcHPLC4（1）（2ab、用并减少了宿主蛋白的污染。
c、分泌到培养基：这种表达一般蛋白质浓度较低，主要受到培养基中的污染。
表4 不同来源的蛋白质样品概述表5 常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数2、离子交换色谱（ion exchange chromatography）蛋白质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH小于其等电点时，带净正电荷，而在缓冲液pH大于脱推c离。
d-凝集素，抗原-抗体等。
近来发展了金属螯合亲和色谱，用于纯化表面含色氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋白质以及(His)6-tagged重组蛋白。
亲和色谱分为特异性亲和色谱和组别亲和色谱两类。
肝素、凝集素、染料、金属螯合亲和色谱均为组别亲和色谱（同一配基可以结合许多种蛋白质）。
e、反相色谱常用于蛋白质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极高，可以分离两种仅相差一个氨基酸的多肽。
如血管紧张素（angiotensin）的几个亚型通过反相色谱可以很好地分离。
同一个样品在同一Source 30 RPC柱上进行分离，由于色谱条件进行了改变，色谱图截然不同，说明反相色谱具有高度的选择性。
四、应用举例例一、一种抗HI gp120单克隆抗体的Fab片断（E.coli中表达）分子量：50 kD最1脱盐，2、破碎细胞，去碎片，抗原用多孔硅玻璃吸附，洗脱，凝胶过滤，甲醛处理，明矾吸附，疫苗。
3、巴斯德研究所：（CHO细胞表达）培养上清液，离心去碎片，50%硫酸铵沉淀，离心，50%KBr处理，脱盐、超滤浓缩、Sepharose CL-4B 凝胶柱分离。
4、Below，M. Bioseparation. 1(1991). 397工艺破细胞，去碎片，加硫酸铵至一定浓度后，直接上Butyl-Sepharose 4 FF疏水柱，脱盐后上DEAE-Sepharose FF，超滤浓缩后上Sepharose 4 FF凝胶过滤柱。
例四、尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离（注射用降纤酶）分子量：38 kD；等电点：~5.4原工艺：阴离子交换，凝胶过滤，第二次阴离子交换，凝胶过滤达到为单峰。
~90%的纯度，经过特异蛋白酶切后，再进行离子交换及高分辨凝胶过滤一般便可以达到所需的纯度（95~99%）。
二、包含体表达蛋白的纯化：在E.coli系统表达重组蛋白，表达量高时，常形成包含体，包含体易于与细胞其他组分分离，但需要注意的是蛋白复性的步骤。
一般采用盐酸胍溶解包含体蛋白后，用稀释的办法进行复性，也可以利用凝胶过滤色谱进行复性（已有多种凝胶可以促进蛋白质的复性的报道）。
以下以rhGM-CSF （重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的下游纯化工艺为例：E.coli细胞，超声破碎，离心收集包含体，用7mol/L盐酸胍溶解包含体蛋白，作1：70稀释使蛋白复性，加硫酸铵至一定浓度后，上样于Phenyl-Sepharose 6 FF（high sub）色谱柱，活性组分再上Q-Sepharose FF进行离子交换，最后上Superdex 75 prep grade凝胶进行凝胶过滤色谱，最终获得了纯度较高的rhGM-CSF，同时，DNA及内毒素去除率均很高。
如下表所示：2、色谱柱装填的好坏：凝胶过滤色谱柱装填完后，一般可以用丙酮（或NaCl）测定柱效和峰对称性，一般对于平均颗粒直径在30~34微米的Superose PG、Superdex PG系列凝胶，柱效应在9000以上，而颗粒平均直径在90微米的Sepharose FF凝胶柱效应在3000以上。
通常，越是分辨率高的细颗粒凝胶对于装柱的技术要求越高。
除了柱效以外，影响分离的因素主要有：a、色谱柱的长短，一般较长的柱分离较好，L/D>20。
但一般商用色谱空柱长100cm左右，最多可以装到90~95cm高左右，如果仍不能取得满意的分辨率，可以用两根相同的凝胶柱，用SRTC-2接头连接后，可以提高分辨率40%。
分离度正比于柱长的平方根。
b、样品浓度，在蛋白浓度小于50mg/ml并且粘度小于5cP（厘泊）的条件下，样品浓度对于分辨率影响较小。
c、上样体积：一般较低的流速下（5~10cm/h）分辨率较高，但Superdex PG，Sepharose FF等新型凝胶可以在较高的流速下分离而不致损失分离度。
二、离子交换色谱：a、凝胶本身的性质：分辨力 Sepharose FF<Sepharose HP<Source 30<Source15（基架）DEAE：弱阴离子 Q：强阴离子选择性有差异CM：弱阳离子 S：强阳离子选择性有差异b、工作缓冲液的pH值：离子交换依赖于分子所带的电荷，故pH对其影响较大，往往0.2~0.5 pH的改变就足以改变色谱结果，具体对于分离某一种蛋白，那一个pH最合适，需要进行大量的实验摸索。
c、上样量：一般保持在结合最大容量的20%以下可以获得较好的分辨率。
但对于样品体积无限制。
dca基架：6 FF （bc、温度：温度升高，疏水作用增强。
d、pH值：在接近中性的范围内，影响不大。
e、样品体积：无影响。
f：流速：在压力许可下，无明显影响。
g、样品浓度：在粘度不超过5cP下，无影响。
h、梯度：较缓的梯度分辨较好。
四、一些蛋白质的分子量与Stokes半径：对蛋2、需要高分辨的分离，杂质和目的蛋白相差2倍以下，则柱效高才有分离很好的把握。
3、测量柱效的方法，一般采用1%丙酮或1mol/L NaCl作为样品，进行分离（上样体积与所用凝胶种类相关），AKTA系列液相色谱仪可以自动在积分后得出每米的塔板数。
我在做一个包含体复性的蛋白纯化，用的是GST purification Glutathione sepharose 4B. 可是发现：在蛋白和凝胶哺育半小时装柱后，我的蛋白还是很多在没来及用elution buffer，只用pbs 洗柱子的时候就脱下来了，不知道是怎么回事啊，是不是盐浓度太低？几点补充：1、凝胶柱，假如进行的仅是“组别分离”，则不测柱效也没关系，比如采用Sephadex G-25对蛋白样品脱盐，或者目的蛋白与杂质分子量相差10倍以上。
2、需要高分辨的分离，杂质和目的蛋白相差2倍以下，则柱效高才有分离很好的把握。
3、测量柱效的方法，一般采用1%丙酮或1mol/L NaCl作为样品，进行分离（上样体积与所用凝胶种类相关），AKTA系列液相色谱仪可以自动在积分后得出每米的塔板数。
液相色谱仪还有塔板数什么的东东是什么样的？我用的AKTA的柱子和介质但好像没有那个东东。
另外怎么使一个凝胶柱装的比较好呢？比如说superose 12PG ,装的是16*40的柱子！！elution buffer的pBS觉是你说wash buffer如果用等组件，流速比HPLC的要大很多，purifier-100和explorer-100主要用于实验室规模的制备，有时也可用于某种分析应用，最高压力10Mpa，用于常规的蛋白质纯化是足够用了。
塔板数的概念很容易找到，就是借鉴化工中精馏的思想，把传质的概念运用到色谱中，这样可以在某种条件下，衡量色谱填装的好坏，也就是柱效的高低，其实色谱是个经验性很强的东东，而且Acetone测定的柱效并不能完全反映大分子在柱内的不断分配和平衡，比如腺病毒大分子用XL的胶分离反而比FF和HP的胶有更高的柱效。
AKTA制备层析仪的工作站Unicorn可以根据采集到峰图数据，自动计算塔板数，非常方便，可以通过HETP和As对于装柱进行指导，还是很有意义的。
Bio-Rad也有类似的仪器，还包括早期的phamacia & LKB的仪器，其实原理都差不多，只是现在做得越来越方便，功能越来越多。
你没有仪器，可以用国产的恒流泵或蠕动泵来做，不过前者压力可以较高（北京卫星厂的可以到8MPa），蠕动泵耐受压力较小。
然后接上国产的U和记录仪来做。
测柱效方法是一样的，不过要用尺子在记录纸上量了，加快走纸速度可以减小误差。
也可以买一套较便宜的N2000工作站，带数据采集卡的，也可以。
你的1）万剂。
23）），对于装柱要求比较严格。
其比较好的分离范围为1000~300000 Da（对蛋白，对核酸完全不同），完全排阻分子量为200万。
理论上说这样粒径在30微米左右的胶，每米的理论塔板数达到1万以上才算柱子装得比较好。
装在16/40的柱子内，柱高最多30多厘米（借助装柱器），对于一般的凝胶过滤来说，柱高稍微短了一些，除非你有把握柱子装得非常好，柱效非常高，或者分离本身不需要很高的分辨力，否则建议使用较高的柱子，比如XK16/70或XK16/100。
（安玛西亚预装的30厘米高的Superose 12 柱，柱高仅30厘米，不过柱效达到40000/米以上，故分辨能力极佳，可以用于代替一般的HPLC凝胶柱）5）另外，假若多次试验表明柱子分离你的样品得到很好的分离，纯度满足你的要求，则无需关心你的柱子柱效是多少，够用就行了。
可否见告你所使用什么泵带柱子？要分离的目的物和杂质分子量的基本情况？谢谢两位的帮助！！哇塞，Superose 12 PG那么贵呀，我是从我们科室一大箱子乱乱的药品中发掘出来的，呵呵，大发现呀！！：）：）to 小龙：泵带柱子？不好意思我不明白是什么，我使用的是那种恒流泵，柱子是Amersham的带套3.8-6来用厘多厘米此外，SDS-PAGE上目的蛋白分子量和杂蛋白分子量差别大，有时不一定凝胶柱能够分离很好，因为在natie状态，存在分子聚合的很大可能。