蛋白质相互作用研究概述
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常见荧光对 • CFP-YFP • BFP-GFP • BFP-YFP • Cy3-Cy5 • FITC-Rhodamine
FRET基本原理
细胞水平蛋白质相互作用验证—荧光共振 能量转移（FRET）
激光共聚焦显微镜观察
流式细胞仪检测 Heetal.,2005,NucleicAcidsResearch
• Pull down
细胞水平蛋白质相互作用验证—共定位
Karen E. Johnson et al. J. Virol. 2013; doi:10.1128/JVI.00082-13
• 不能明确蛋白质之间的直接作 用
• 内源蛋白的检测 • 荧光蛋白融合蛋白检测 • 标签融合蛋白的抗体检测
细胞水平蛋白质相互作用验证—荧光共振 能量转移（FRET）
相互作用 vs 相互结合
基于已知结构的分子对接
• Z-Dock • Struct2Net • Meta-PPISP • ......
4、新的结合蛋白的筛选
寻找结合蛋白常用技术
• 酵母双杂交 • Pull down • 蛋白质组学 • 噬菌体展示技术
酵母双杂交—原理
• DNA结合结构域bait
酵母双杂交
Pull down
蛋白质组学 噬菌体展示技术
细胞水平验证
共定位
X1蛋白 X2蛋白 X3蛋白
……
免疫共沉淀 FRET BiFC
酵母双杂交
A-X相互作用
生物化学水平验证
生物学功能水平
斑点杂ห้องสมุดไป่ตู้ 免疫共沉淀
A-X相互作用
Pull down 表面等离子共振技术
生物膜层干涉技术
A-X结合
功能分析 RNAi及rescue
不适用于结合力弱或 者瞬间结合的蛋白互 作研究
GST pull down pull down技术可用 于检测蛋白之间的直 接互作关系（与CoIP相比）
非生理状态； GST标签对蛋白质构 象的影响
Strep亲和层析 亲和力强，避免抗体 的影响； 新的短tag降低标签对 蛋白质构象星星。
结合力弱的蛋白难以 被检测到
1. 针对亲和力弱的蛋白：DSS交联 解决方法 2. 针对假阳性蛋白：设置对照组
3. 针对筛选到的蛋白少：进行组学分析
5、蛋白质相互作用的验证
蛋白质相互作用验证方法
细胞水平 • 共定位 • 荧光共振能量转移（FRET） • 双分子荧光互补（BiFC） • 免疫共沉淀 • 酵母双杂交
生物化学水平 • 斑点杂交 • 表面等离子共振 • 生物膜层干涉技术 • 免疫共沉淀
1 研究蛋白质相互作用的目的和意义 2 蛋白质相互作用研究一般思路 3 生物信息学预测蛋白质相互作用 4 新的结合蛋白的筛选 5 蛋白质相互作用的验证
1、研究蛋白质相互作用的意义
蛋白质主要通过直接相互作用发挥功能
• 实物vs场 →光遗传学（ChR2）、磁蛋白（MagR）
• 力、热、光、电
→大多数蛋白质主要通过直接接触的作用方式发挥功能： • 信号转导：受体-配体结合，受体细胞内信号传递 • 酶活性激活与调节：多亚基酶复合物 • 细胞运动：肌纤维 ……
蛋白质相互作用研究概述
• Nature网站检索protein-protein interaction，有20105条结果
新型冠状病毒刺突蛋白与ACE2结合的冷冻电镜结构
Spike 蛋白结构
Spike蛋白表达与纯化
2019-nCoV传染性远远强于SARS-CoV的结构基础
目录
CONTENTS
• 转录激活结构域prey
GAL4 报告系统
• pGBKTV7 • pGADT7
酵母双杂交—载体系统
酵母双杂交—基本流程
• 已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)， 将其与DB结构域融合，构建成诱饵质 粒（pGBKT7,AH109及Y187）
• 将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活 域融合，构建成文库质粒（pGADT7， AH109）。
HIV gp120与CCR5结合介 导HIV-1感染宿主细胞
丙酮酸脱氢酶复合物
肌纤维
蛋白质相互作用的类型
• 同源寡聚体、异源寡聚体 • 永久、瞬时 • 共价、非共价 • 互作、结合（interaction、
binding）
发掘新的蛋白质-蛋白质相互作用的意义
• 解析新的生理病理机制，高影响力的研究论文 • 新的药物靶点，巨大的应用价值和市场前景
通过KD明确亲和力
组学数据挖掘及生物信息学预测 相互作用/结合蛋白发掘
蛋白质相互作用/结合验证 生物学功能研究
细胞 水平
生物化学 水平
新机制、新靶点
感谢您的观看
A-X互作、结合 功能相关
3、生物信息学预测蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用预测原理
• 基于与已知相互作用蛋白的相似性 • 基于基因共表达网络，结构域融合 • 对蛋白质表面特征的计算
已知的蛋白质相互作用数据库
• IntAct • HPRD • DIP • BioGRID • MINT • String • Reactome • Hitpredict
• 根据结构相似性推测 PD1配体
根据序列相似性搜索的到的PD-L1
流式细胞检测PD-1/PD-L1结合
SPR检测PD1/PD-L1结合
2、蛋白质相互作用研究一般思路
蛋白质相互作用研究分类
• 发掘、验证 • 细胞水平、生物化学水平 • 生理蛋白、重组表达蛋白
A蛋白
筛选
生物信息学分析 及预测
Co-IP、pull down及亲和层析
Co-IP
GST pull down
Strep affinity chromatography
技术 优点
各项技术 优缺点
缺点
Co-IP
接近天然相互作用， 符合体内真实生理情 况； 实验条件温和，可避 免人为的影响； 可分离得到天然状态 的相互作用蛋白复合 物。
• 将这两个质粒共转化于酵母细胞中， 或者Mating。
• 利用4种报告基因的表达，筛选阳性 克隆。
• 阳性克隆进一步验证
Co-IP、pull down及亲和层析
• Co-IP • GST pull down • Affinity choromatography
• SDS-PAGE • Western Blot • 2D-PAGE • LC-MS
双分子荧光互补（BiFC）
pBiFC-VN173
pBiFC-VC155
表面等离子共振
芯片： 1. CM5芯片：氨基、巯基、醛基
共价偶联。 2. SA芯片：链霉亲和素，可捕获
生物素标记的蛋白 3. NTA芯片：结合his 4. HPA芯片：疏水表面，膜蛋白
分析
5. ……
KD=Ka/kd
生物膜层干涉
FRET基本原理
细胞水平蛋白质相互作用验证—荧光共振 能量转移（FRET）
激光共聚焦显微镜观察
流式细胞仪检测 Heetal.,2005,NucleicAcidsResearch
• Pull down
细胞水平蛋白质相互作用验证—共定位
Karen E. Johnson et al. J. Virol. 2013; doi:10.1128/JVI.00082-13
• 不能明确蛋白质之间的直接作 用
• 内源蛋白的检测 • 荧光蛋白融合蛋白检测 • 标签融合蛋白的抗体检测
细胞水平蛋白质相互作用验证—荧光共振 能量转移（FRET）
相互作用 vs 相互结合
基于已知结构的分子对接
• Z-Dock • Struct2Net • Meta-PPISP • ......
4、新的结合蛋白的筛选
寻找结合蛋白常用技术
• 酵母双杂交 • Pull down • 蛋白质组学 • 噬菌体展示技术
酵母双杂交—原理
• DNA结合结构域bait
酵母双杂交
Pull down
蛋白质组学 噬菌体展示技术
细胞水平验证
共定位
X1蛋白 X2蛋白 X3蛋白
……
免疫共沉淀 FRET BiFC
酵母双杂交
A-X相互作用
生物化学水平验证
生物学功能水平
斑点杂ห้องสมุดไป่ตู้ 免疫共沉淀
A-X相互作用
Pull down 表面等离子共振技术
生物膜层干涉技术
A-X结合
功能分析 RNAi及rescue
不适用于结合力弱或 者瞬间结合的蛋白互 作研究
GST pull down pull down技术可用 于检测蛋白之间的直 接互作关系（与CoIP相比）
非生理状态； GST标签对蛋白质构 象的影响
Strep亲和层析 亲和力强，避免抗体 的影响； 新的短tag降低标签对 蛋白质构象星星。
结合力弱的蛋白难以 被检测到
1. 针对亲和力弱的蛋白：DSS交联 解决方法 2. 针对假阳性蛋白：设置对照组
3. 针对筛选到的蛋白少：进行组学分析
5、蛋白质相互作用的验证
蛋白质相互作用验证方法
细胞水平 • 共定位 • 荧光共振能量转移（FRET） • 双分子荧光互补（BiFC） • 免疫共沉淀 • 酵母双杂交
生物化学水平 • 斑点杂交 • 表面等离子共振 • 生物膜层干涉技术 • 免疫共沉淀
1 研究蛋白质相互作用的目的和意义 2 蛋白质相互作用研究一般思路 3 生物信息学预测蛋白质相互作用 4 新的结合蛋白的筛选 5 蛋白质相互作用的验证
1、研究蛋白质相互作用的意义
蛋白质主要通过直接相互作用发挥功能
• 实物vs场 →光遗传学（ChR2）、磁蛋白（MagR）
• 力、热、光、电
→大多数蛋白质主要通过直接接触的作用方式发挥功能： • 信号转导：受体-配体结合，受体细胞内信号传递 • 酶活性激活与调节：多亚基酶复合物 • 细胞运动：肌纤维 ……
蛋白质相互作用研究概述
• Nature网站检索protein-protein interaction，有20105条结果
新型冠状病毒刺突蛋白与ACE2结合的冷冻电镜结构
Spike 蛋白结构
Spike蛋白表达与纯化
2019-nCoV传染性远远强于SARS-CoV的结构基础
目录
CONTENTS
• 转录激活结构域prey
GAL4 报告系统
• pGBKTV7 • pGADT7
酵母双杂交—载体系统
酵母双杂交—基本流程
• 已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)， 将其与DB结构域融合，构建成诱饵质 粒（pGBKT7,AH109及Y187）
• 将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活 域融合，构建成文库质粒（pGADT7， AH109）。
HIV gp120与CCR5结合介 导HIV-1感染宿主细胞
丙酮酸脱氢酶复合物
肌纤维
蛋白质相互作用的类型
• 同源寡聚体、异源寡聚体 • 永久、瞬时 • 共价、非共价 • 互作、结合（interaction、
binding）
发掘新的蛋白质-蛋白质相互作用的意义
• 解析新的生理病理机制，高影响力的研究论文 • 新的药物靶点，巨大的应用价值和市场前景
通过KD明确亲和力
组学数据挖掘及生物信息学预测 相互作用/结合蛋白发掘
蛋白质相互作用/结合验证 生物学功能研究
细胞 水平
生物化学 水平
新机制、新靶点
感谢您的观看
A-X互作、结合 功能相关
3、生物信息学预测蛋白质相互作用
蛋白质-蛋白质相互作用预测原理
• 基于与已知相互作用蛋白的相似性 • 基于基因共表达网络，结构域融合 • 对蛋白质表面特征的计算
已知的蛋白质相互作用数据库
• IntAct • HPRD • DIP • BioGRID • MINT • String • Reactome • Hitpredict
• 根据结构相似性推测 PD1配体
根据序列相似性搜索的到的PD-L1
流式细胞检测PD-1/PD-L1结合
SPR检测PD1/PD-L1结合
2、蛋白质相互作用研究一般思路
蛋白质相互作用研究分类
• 发掘、验证 • 细胞水平、生物化学水平 • 生理蛋白、重组表达蛋白
A蛋白
筛选
生物信息学分析 及预测
Co-IP、pull down及亲和层析
Co-IP
GST pull down
Strep affinity chromatography
技术 优点
各项技术 优缺点
缺点
Co-IP
接近天然相互作用， 符合体内真实生理情 况； 实验条件温和，可避 免人为的影响； 可分离得到天然状态 的相互作用蛋白复合 物。
• 将这两个质粒共转化于酵母细胞中， 或者Mating。
• 利用4种报告基因的表达，筛选阳性 克隆。
• 阳性克隆进一步验证
Co-IP、pull down及亲和层析
• Co-IP • GST pull down • Affinity choromatography
• SDS-PAGE • Western Blot • 2D-PAGE • LC-MS
双分子荧光互补（BiFC）
pBiFC-VN173
pBiFC-VC155
表面等离子共振
芯片： 1. CM5芯片：氨基、巯基、醛基
共价偶联。 2. SA芯片：链霉亲和素，可捕获
生物素标记的蛋白 3. NTA芯片：结合his 4. HPA芯片：疏水表面，膜蛋白
分析
5. ……
KD=Ka/kd
生物膜层干涉