组培实验

实验一：组培室的设计及仪器设备的使用
一、实验目的
1.了解普通植物组织培养实验室和工厂育苗植物组织培养室的差别；
2.掌握植物组织培养实验室的组成及各分室的功能；
3.学会分析各种类型植物组织培养实验室的优点和缺点；
4.学会常见植物组织培养设备的使用方法。

二、试验原理
1.物组织培养实验室是完成植物组织培养的重要场所，植物组织培养实验室设计合理与否直接影响着植物组织培养的成败。

2.植物组织培养实验室有：准备室药品储藏室、洗涤室、培养基配制室、灭菌室）、接种室、培养室、温室。

(1)准备室
在准备室主要进行一些常规实验操作，如各种药品的储备，称量，器皿洗涤，培养基配制，培养基和培养器皿的灭菌，培养材料的预处理等。

为了方便管理还可以将准备室进行适当的分区，如划分为药瓶储藏室，洗涤室，培养基配制室及灭菌室等。

①药品储藏
主要用于存放各种化学药品，要求室内干燥、通风、避光、应配制、备药品柜、冰箱等。

各类化学试剂应按要求分类存放，需要低温保存
的药剂应置于冰箱内保存，有毒药品应按规定存放和管理。

②洗涤室
用于玻璃器皿、用具及实验用具的洗涤、干燥和存放;；培养材料的预处理与清洗：组培苗的出瓶、清洗与整理等。

要求有电源、自来水和水槽，上下水道畅通，排水良好，地面耐湿、防滑，便于清洁。

应配备工作台、烘箱、晒瓶架、周转筐、毛刷等。

③培养基配制室
用于培养基的配制，还可以分为称重分室和配制分室。

药品称量需配制各种规格的天平，包括普通天平和分析天平。

培养基配制需要配备工作台、蒸馏水器、电炉（电饭锅或微波炉）、水浴锅、磁力搅拌器、过滤装置、酸度计、分注器、各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、吸管、移液管及移液管架以及贮藏母液的冰箱、移动式载物台（医用小推车）、周转筐等。

④灭菌室
用于培养基、器皿、用具、及其它物品的灭菌。

灭菌室根据工作量的大小决定其面积的大小，一般控制在30～50m²。

要求、通风、明亮，墙壁和地面应防潮、耐高温。

应配置高压电源和排水设施、高压蒸汽灭菌装置、干热消毒柜或烘箱、细菌过滤装置及移动式载物台、周转筐等。

准备室也可设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间按程序完成，以便于程序化操作与管理，从而提高工作效率。

此外还
便于培养基的配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，从而减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌操作体系的建立。

(2)、无菌操作室（接种室）
无菌操作室也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的继代转接等无菌操作。

由于植物组织培养时间较长，尤其需要防止细菌、真菌污染。

因此，接种室内无菌条件控制的好坏直接影响培养物的污染率及接种工作效率等重要指标。

接种室面积根据需要和环境控制的难易程度而定，在工作方面的前提下易小不宜大。

室内地面、墙面、天花板应采用防水或耐腐蚀材料，符合无尘积累要求，易于清洁和消毒；门窗要求密闭性好，一般用滑动门窗，不能安装风扇，通风换气需通过空气调节装置进行。

无菌室内安装紫外灯，每周照射1～2h，每次使用前照射10～30min；定期用甲醛和高锰酸钾（或用臭氧发生器）熏蒸消毒。

接种室内应配备超净工作台、灭菌器或酒精灯、酒精瓶及酒精棉球、接种工具、器械支架及移动式载物台。

接种室外还应设置预备室作为缓冲间，一方面可供操作人员更换工作服、工作帽、拖鞋及器皿准备、培养材料处理等，另一方面可减少工作人员将外界尘埃、杂菌等污染物直接带入接种室内。

缓冲间与接种室之间最好安装塑钢玻璃及滑动门，以便于观察；而且缓冲间与接种室的门应该错开，也不得同时开启，以防止在工作人员进出时空气对流带入杂菌。

缓冲间内应配备鞋架和衣帽挂钩，并备有清洁的工作服、工作帽、口罩及拖鞋；墙顶应安装12盏紫外灯，定时照射杀菌。

(3)、培养室：
用于对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养。

培养室内放置培养架，方便操作，.并充分利用空间。

培养室的大小可根据生产规模和培养架的大小、数目及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。

可采取多室设计方式，每个培养是面积不宜过大，约10～20㎡，以满足不同培养材料对环境条件控制的不同要求，也便于对同室内环境条件的均匀控制。

室内天花板和内墙最好用塑钢板或瓷砖装修，地面铺设水模式或瓷砖，以保持室内明亮、平整，并方便清洁和消毒；室内还要安装紫外灯，定时进行杀菌处理。

培养室内需要安装空调，以控制室内温度，一般要求保持在20～27℃之间，低于15℃或高于35℃对植物的生长不利。

培养室的光源一般使用白色日光灯，光周期可采用自动定时器来控制，光照强度一般控制为1000～6000lx，每天光照时间微10～16h。

需要大量的暗培养时可以增设暗培养室，或使用暗箱培养。

培养室内的相对湿度保持在70％～80％为宜。

湿度过高，容易使培养及污染；湿度过低，容易使培养基失水变硬，影响培养物生长。

在梅雨季节可使用除湿机人工除湿，干燥季节可利用加湿器来增加湿度，也可采取防治水盆的方法来调节湿度。

3.高压灭菌锅、超净工作台等都是组培室必不可少的仪器和设备，只有科学正确的学会它们的使用方法，才能确保组培的成功。

三、主要仪器、试剂、材料
1、主要仪器：
植物组织培养所使用的器材种类较多，通常有两种分类方法，一是按照在组培室内功能区域划分，分为接种间器械、灭菌间器械、洗刷间设备、培养间设备、配制间设备及辅助设备等，另一种是按使用目的分，分为通用器具、盛具、计量器械、灭菌器械、接种器械、培养器械等几种类型。

下面按第二种分发进行介绍：
（1）盛具类：
①搪瓷浅盘②塑料盆③铁丝筐④纯水水桶⑤塑料桶⑥各种规格的磨
砂玻璃瓶
（2）通用器械：
①烧杯：用来盛放、溶解化学药剂等。

常用的规格有50ml、100ml、250ml、500ml、1000ml。

②烘箱：用来烘干器械。

③恒温水浴：用来溶解琼脂等物质。

④玻璃搅拌棒：用来配制培养基。

⑤洗耳球：用来辅助吸取、转移少量液体。

⑥冰箱：用来贮存化学药剂、植物材料等。

⑦牛角勺：用来转移化学药剂。

⑧玻璃漏斗：用来过滤溶液。

⑨剪刀：用来修剪外植体或剪切嫩茎。

⑩器械架：在无菌操作期间用来放置灭菌的器械。

（3）计量器械：
①量筒：用来量取一定体积的液体。

常用的规格有25ml、50ml、100ml、500ml、1000ml。

②容量瓶：用来配制标准溶液。

常用的规格有50ml、100ml、500ml、1000ml。

③大肚移液管：用来吸取定量溶液。

常用的规格有1ml、5ml、10ml。

④刻度移液管：用来吸取定量植物生长物质溶液。

常用的规格有1ml、
5ml、10ml。

⑤移液管架：用来放置、固定移液管。

⑥酸度计：用来检测培养基的pH。

⑦药物天平：用来称取配制培养基的药品。

⑧分析天平：用来称取少量有化学试剂，进行化学分析。

（4）接种器械①超净工作台：用来过滤通过接种工作台面的空气，以便进行无菌操作。

②小型喷雾器：装载灭菌药液，来给超净工作台等处喷雾灭菌。

③钝头镊子：在接种操作、继代培养时移取植物材料。

④尖头镊子：用来分离植物材料。

⑤解剖刀：用来切割植物材料。

⑥打孔器：用来切取大小一致的圆柱形植物材料。

⑦双目显微镜：在解剖较小的外植体时，用来观测材料。

⑧细菌滤膜：用来进行溶液的常温除菌。

⑨接种针：用来转移细胞团、愈伤组织。

（5）灭菌器械：
①磨砂口玻璃瓶：用来对植物材料进行表面灭菌。

②酒精灯：用来进行接种器材的表面灭菌。

③细菌过滤器：用来过滤不能进行高温灭菌的试剂溶液。

④无菌滤纸：用来汲取器材、植物材料表面的水分。

⑤无菌脱脂棉：用来进行器械、植物材料表面的灭菌处理。

⑥真空泵：用来吸滤灭菌。

⑦高压灭菌锅：对培养基、接种器材进行灭菌处理。

⑧可调试电炉：用来加热高压灭菌锅。

⑨皮下注射器：用来对溶液进行过滤、除菌。

⑩紫外线灭菌灯：用来对接种室、培养室、操作室等工作环境进行灭菌处理。

（6）培养器械：
①试管：用来作为外植体的培养容器。

常用的规格有2cm×15cm、3cm×15cm。

②培养皿：用来作为外植体的培养容器。

常用的规格
有直径9cm、12cm。

③锥形瓶：即三角烧瓶，主要作为培养器材，常用的规格有50ml、100ml。

④显微镜：用来观察植物材料。

⑤成套载玻片：用来制作植物材料显微制片。

⑥铝箔：用于培养容器封口。

⑦橡皮筋：用来束紧培养容器的封口材料。

⑧血球计数器：用来进行植物细胞计数。

⑨空调：用来调节操作间、培养室的温度。

⑩摇床：用来进行细胞悬浮培养。

（7）主要仪器的一些相关简介
万分之一天平
来源：昆明联网衡器有限公司
产品简介：四级防震，称量速度可调显示方式可调动态温度补偿全量程范围去皮自动零位跟踪可调自动故障诊断自动校准过载保护超载报警功能计数、百分比称重功能克、盎司、克拉等单位换。

温度补偿全量程范围去皮自动零位跟踪可调自动故障诊断自动校准过载保护超载报警功能计数、百分比称重功能克、盎司、克拉等单位转换
托盘天平
简介：一种实验室常用的称量用具由托盘、横梁、平衡螺母、刻度尺、指针、刀口、底座、标尺、游码、砝码等组成。

精确度一般为0.1g或0.2g，荷载有100g、200g、500g、1000g等。

中文名:托盘天平
外文名：Counter balance
3、使用方法
1.要放置在水平的地方，游码要指向红色0刻度线。

2.调节平衡螺母(天平两端的螺母)调节零点直至指针对准中央刻度线。

(游码必须归“0”平衡螺母向相反方向调，使用口诀：左高端，向左调。

)
3.左托盘放称量物，右托盘放砝码。

根据称量物的性状应放在玻璃器皿或洁净的纸上，事先应在同一天平上称得玻璃器皿或纸片的
天平结构图
或托着一个盘，其中一个盘（通常为右盘）里放着已知重量的物体（砝
码），另一个盘（通常为左盘）里放待称重的物体，游码则在刻度尺
上滑动。

固定在梁上的指针在不摆动且指向正中刻度时或左右摆动幅
度较小且相等时，砝码重量与游码位置示数之和就指示出待称重物体
的重量。

XFH-50MA电热式压力蒸汽灭菌器医疗蒸汽灭菌
器灭菌锅50L
型号：XFH-50MA
适用范围：茶餐厅设备,蛋糕房设备,面包房设备,咖啡店设备,饮品店设备中餐店设
备,西餐店设备,酒厂设备,调料加工厂设备,果蔬加工厂设备冷冻食品厂设备肉制品加设备,休闲食品厂设备
产品参数
功能
◆手轮式快开门结构
◆机械式安全联锁装置
◆超压自泄
0.145-0.165Mpa
◆最高工作温度126℃-128℃◆断水保护控制
◆指示灯显示工作状态
◆自胀式密封
◆双刻度二类读数压力表
◆全不锈钢材料
◆操作简便、安全可靠
技术参数
◆特点
1.垂直层流送风，防止操作室内部样品相互交叉污染。

2.采用超高效无隔板过滤器，对0.3微米的颗粒过滤效率达到99.99%(操作区洁净度远高于100级）．
3.采用触摸式控制器，可调风速风机系统，噪音低，振动小，保证工作区风速始终处于理想状态。

4.高品质离心式，超低噪音风机。

5.正压式过滤系统，确保工作区域为无尘无菌环境。

6.工作台面选用优质304不锈钢材质，美观、易清理、耐腐蚀。

7.箱体表面采用静电喷涂工艺，耐酸碱，美观大方。

8前后窗采用全钢化玻璃视窗及配重平衡，既可保证操作者的人身安全又任意升降，定位灵活
9.分体式结构，下设角轮。

10.可选配控制面板为风速可调（0.3~0.6m/s）.及带紫外杀菌定时功能
2、主要材料：各种植物材料。

3、主要试剂：各种大量元素、微量元素、植物生长调节剂、各种有机添加物质等。

四：实验步骤
1、组培室的组成及其功能了解
植物组织培养实验室通常包括：准备室（药品储藏室、洗涤室、培养基配制室、灭菌室）、无菌操作室、培养室、温室等。

（1）准备室：
在准备室主要进行一些常规实验操作，如各种药品的储备，称量，器皿洗涤，培养基配制，培养基和培养器皿的灭菌，培养材料的预处理等。

为了方便管理还可以将准备室进行适当的分区，如划分为药瓶
储藏室，洗涤室，培养基配制室及灭菌室等。

①药品储藏：
主要用于存放各种化学药品。

②洗涤室：
用于玻璃器皿、用具及实验用具的洗涤、干燥和存放;；培养材料的预处理与清洗：
组培苗的出瓶、清洗与整理等。

③培养基配制室：
用于培养基的配制，还可以分为称重分室和配制分室。

药品称量需配制各种规格的天平，包括普通天平和分析天平。

④灭菌室：
用于培养基、器皿、用具、及其它物品的灭菌。

（2）、无菌操作室（接种室）：
无菌操作室也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的继代转接等无菌操作。

（3）、培养室：
用于对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养。

2、组培室的规划设计：
（1）、布局基本要求：
①便于隔离；②便于操作；③便于灭菌；④便于观察。

（2）、基本布局规律：
①根据实验操作程序排列实验室；②接种室和培养室设在与外界环境隔离性好的区域；③灭菌室与接种室相邻；④其他实验室的布局可根据条件，以方便使用为宜
（3）、总体实验室要求：
理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。

规模化生产的组织培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。

实验室的建设均需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费和实验性质。

无论实验室的性质和规模如何，实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。

一个组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。

此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室更加完善。

在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。

实验室的大小取决于工作的目的和规模。

以工厂化生产为目的，实验室规模太小，则会限制生产，影响效率。

在设计组织培养实验室时，应按组织培养程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。

植物组织培养是在严格无菌的条件下进行
的。

要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。

（4）组培室的分类：
一是：分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，但不适于大规模生产。

二是：通间式-规模化实验室，准备室一般设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。

准备试验的过程在同一空间进行，便于程序化操作与管理，试验中减少各环节间的衔接时间，从而提高工作效率。

1准备室：
①要求：便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，从而减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。

②设备：准备室应具备实验台、药品柜、水池、仪器、药品、防尘橱（放置培养容器）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器等。

2、洗涤灭菌室：
①要求：洗涤灭菌室根据工作量的大小决定其大小，一般面积控制在30-50m2。

在实验室的一侧设置专用的洗涤水槽，用来清洗玻璃器皿。

中央实验台还应配置2个水槽，用于清洗小型玻璃器皿。

如果工作量大，可以购置一台洗瓶机。

准备1-2个洗液缸，专门用于洗涤对洁净度要求很高的玻璃器皿，地面应耐湿并排水良好。

②设备：水池、落水架、中央实验台、高压灭菌锅、超声波清洗器、干燥灭菌器（如烘箱）等。

3、无菌操作室（接种室）：
①要求：接种室宜小不宜大，一般7～8平米（10-20平米）即可，其规模根据实验需要和环境控制的难易程度而定。

要求封闭性好，干爽安静，清洁明亮，能较长时间保持无菌，因此不易设在容易受潮的地方；地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒；配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；为了保持清洁，无菌室应防止空气对流。

接种室要求在适当位置吊装 1～2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。

最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。

一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸，并需定期灭菌处理，还可用紫外线照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。

②设备：紫外灯、空调、解剖镜、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针），实验台、和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。

4、缓冲间：
①要求：缓冲间需3-5平方米，可建在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。

缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。

缓冲间的门应该与接种室的门错开，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌。

②设备：1-2盏紫外灯、水槽、实验台、鞋帽架、柜子、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。

5、培养室：
①要求：约需 10-20平方米左右，培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定，其设计以充分利用空间和节省能源为原则。

基本要求是能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。

研究用实验室，通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室，也可以根据温度设置成高温和低温培养室，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。

进行精细培养类型如细胞培养和原生质体培养，可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。

为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，
并安上排气扇。

室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。

天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。

培养室外应有一预备间或走廊。

培养材料放在培养架上培养。

培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约1lOcm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高 1．7m左右。

培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长I．3m，30W的长lm，宽度一般为60cm。

日光灯一般用40W，固定在培养架的侧面或搁板的下面，每层有两支日光灯，距离在20cm，光照强度为2000-3000lx。

培养室最重要的因子是温度，一般保持在20—27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。

由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。

室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70%～80%为好，可安装加湿器。

控制光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h，也有的需要连续照明。

短日照植物需要短日照条件，长日照植物需要长日照条件。

现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。

在阴雨天可用灯光作补充。

②设备：培养架（控温控光控湿）、摇床、转床、自动控时器、紫外灯、光照培养箱或人工气候
箱、生化培养箱、边台实验台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。

五、实验讨论及思考题解答
1、请绘制出植物组织培养实验的组成结果示意图并说明各分室的结果功能、
植物组织培养实验室通常包括：准备室（药品储藏室、洗涤室、培养基配制室、灭菌室）、无菌操作室、培养室、温室等。

（1）准备室：在准备室主要进行一些常规实验操作，如各种药品的储备，称量，器皿洗涤，培养基配制，培养基和培养器皿的灭菌，培养材料的预处理等。

为了方便管理还可以将准备室进行适当的分区，如划分为药瓶储藏室，洗涤室，培养基配制室及灭菌室等。

①药品储藏：主要用于存放各种化学药品。

②洗涤室：用于玻璃器皿、用具及实验用具的洗涤、干燥和存放;；培养材料的预处理与清洗：组培苗的出瓶、清洗与整理等。

③培养基配制室：用于培养基的配制，还可以分为称重分室和配制分室。

药品称量需配制各种规格的天平，包括普通天平和分析天平。

④灭菌室：用于培养基、器皿、用具、及其它物品的灭菌。

（2）、无菌操作室（接种室）：无菌操作室也叫接种室，主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的继代转接等无菌操作。

（3）、培养室：用于对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养。

自设植物组织培养实验室平面图
2、请详细说明高压灭菌锅，超净工作台的操作技术要点。

（1）高压灭菌锅的操作流程
①在使用前先检查下面排气瓶里的水位，要使其介于最高线和最低线的中间位置偏下，否则要将水倒出，再继续操作。

（注：此水壶是蒸汽冷凝后接冷凝水的，与锅内的水位无关）
②逆时针方向转开排气阀把手，然后横向向右滑开盖子。

（如果是在操作过程中打开要注意保证压强为0，温度低于97℃，以免造成不必要的伤害）
③拿出上面的篮子，向里面加RO水/单蒸水，使水位线至少超过最下面篮子底部（如果里面有水，需检查水位，并保证水没有被污染，否。