大肠杆菌中重组蛋白可溶性表达的研究进展及展望
Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化
Nanog蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及发酵优化摘要：Nanog蛋白能够维持胚胎干细胞的自我更新与多能性，是关键的转录因子。
目前Nanog蛋白的体外生产形式主要通过微生物进行异源表达，为了能够高效制备可溶性的人源Nanog蛋白，降低Nanog蛋白的应用成本，本研究通过分子克隆技术构建重组大肠杆菌，通过IPTG诱导来进行可溶性的融合表达。
关键词：Nanog;原核表达;蛋白质纯化;发酵优化Nanog蛋白于2003年被发现，一直以来主要通过动物细胞分离提取获得，这种获取方式的缺点在于过程过于繁琐且产率较低。
现阶段已经成功通过大肠杆菌实现了小鼠来源的Nanog蛋白表达，但其产物是包涵体。
通过大肠杆菌实现的人源Nanog假基因的蛋白原核表达，产物也是包涵体。
虽然目前市面上已经有人源Nanog蛋白销售，但并没有人源Nanog蛋白表达的相关研究报道，而且人源Nanog蛋白的售价十分昂贵，为了降低其应用成本和促进医学实验研究，便于后期大量制备Nanog多克隆抗体，本次研究通过pET32a-Nanog构建重组质粒转入到大肠杆菌中，实现人源Nanog蛋白和硫氧还蛋白的可溶性容和表达，最终通过肠激酶酶切后得到人源Nanog蛋白，通过摇瓶来对诱导温度、诱导剂含量以及补料碳源进行优化，在15L的发酵罐上进行补料发酵的分批考察，对不同的温度控制和溶氧水平对菌体产蛋白的影响进行观察，为后期大规模制备人源Nanog蛋白和多克隆抗体打下良好基础。
1、材料与方法1.1实验材料1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌、载体和均为本实验室保存。
1.1.2 试剂与培养基（1）种子培养基：胰蛋白胨、酵母提取物均在温度下进行的灭菌处理。
（2）斜面保藏培养基：胰蛋白胨酵母提取物、琼脂均在温度下进行的灭菌处理。
（3）发酵培养基：葡萄糖蛋白胨酵母粉5g/L，均在温度下进行的灭菌处理。
（4）补料培养基：的甘油溶液。
（5）试剂：加拿大产聚合酶、限制性内切酶；国产酵母膏、胰蛋白胨、质粒小量提取试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、胶回收试剂盒；国产氨苄霉素、免抗Nanog多克隆抗体及羊抗兔的二抗、核糖核酸酶。
蛋白质表达和重组技术的研究进展
蛋白质表达和重组技术的研究进展近年来，随着生物技术的快速发展，蛋白质表达和重组技术在生命科学领域逐渐成为研究的热点。
蛋白质是生命体系中至关重要的分子，具有多种生物学功能。
研究蛋白质的表达和重组技术，对于深入了解蛋白质的结构和功能，以及开发新的药物和治疗方案具有重要意义。
本文将探讨蛋白质表达和重组技术的研究进展。
一、蛋白质表达技术1.1 原核表达系统原核表达系统是最简单直接的表达蛋白质的方式，其依赖于大肠杆菌等细菌对异源蛋白质的转录和翻译。
然而，原核表达系统存在缺点，如对毒性蛋白质的表达效率低、容易出现蛋白质降解和无法产生复杂的多肽等。
这些限制问题在一定程度上阻碍了蛋白质表达的广泛应用。
1.2 真核表达系统真核表达系统来源于真核生物细胞对RNA翻译的机制，包括CHO、293、HeLa等细胞。
真核表达系统不仅能够处理复杂的蛋白质结构，还可以避免对细菌产生的内毒素的依赖，提高表达效率。
但是，真核表达系统明显比原核表达系统更昂贵，并需要更多的时间和精力。
1.3 内含子释放策略内含子释放策略是实现高效蛋白质表达的新方法之一，它允许对特定蛋白质编码基因中的内含子进行剪切，以提高转录效率。
这种方法在真核表达系统中使用，可以在多种细胞系中表达高效的蛋白质。
二、蛋白质重组技术2.1 大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是最广泛使用的重组蛋白质表达系统之一。
该系统具有简单高效、价格低廉、容易操作和产量高等优点。
大肠杆菌表达系统借助贝塞尔表达和双重放大策略，可实现大量的蛋白质表达。
此外，大肠杆菌表达系统还可以通过调整分子量，实现对蛋白质结构和活性的改变，使得其在生物学和医学实验中被广泛应用。
2.2 昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统即利用昆虫细胞（浮游细胞或培养细胞）作为重组蛋白质的宿主。
昆虫细胞表达系统具有产量高、保真度高等优点，而且方法简单，易于进行大规模生产。
不过，昆虫细胞表达系统的缺点是成本较高，而且目前开发出的细胞系较为有限。
重组蛋白Hd3a在大肠杆菌中的表达、纯化及活性研究
ｇ ｒ ａ ｎ ｄ ｉ ｆ ｌ ｏ ｒ ｉ ｕ ｍ ａ ｎ ｄ Ｐ ｈ ａ ｌ ａ ｅ ｎ ｏ ｐ ｓ ｉ ｓ ａ ｍａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｓ ｂ ｙ ｉ ｎ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｍ ｉ ｎ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｌ ｅ ａ ｖ ｅ ｏ ｒ ｓ ｔ ｅ ｍ．
中图分 类 号 ： Ｑ７ ８ ４ 文献 标 志码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ６ — ４ ３ ０ ３ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ６ — ０ ６ ０ １ — ０ ４
Ｔｈｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ，ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎｔ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ Ｈｄ ３ａ ｉ ｎ Ｅｓ ｃ ｈｅ ｒ ｉ ｃ ｈｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ
朱廷 恒 ， 方 三余 ， 严 宏波 ， 张 超。 ， 汪 琨 ， 崔 志峰
（ １ ＿ 浙 江工 业 大学 生 物 与 环 境 工 程 学 院 ， 浙江 杭州 ３ １ ０ ０ ３ ２ ； ２ ． 浙江传化生物技术公 司， 浙江 杭州 ３ １ １ ２ １ ５ ）
摘要： 开花 素在植 物 开花 周期 中起 着 决定性 的作 用 ， 其 本 质是 植 物 叶 片 内产 生 的 可移 动 蛋 白， 并 转
第４ １卷 第 ６期 ２ ０ １ ３年 １ ２月
浙 江 工 业 大 学 学 报
Ｊ ０Ｕ ＲＮＡＬ ０Ｆ ＺＨＥ Ｉ ＡＮＧ ＵＮＩ ＶＥＲＳ Ｉ ＴＹ ＯＦ ＴＥ ＣＨ ＮＯＬＯＧＹ
综述：大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战
大肠杆菌中重组蛋白的表达：进展与挑战毫无疑问，重组蛋白在微生物中的表达革新了生物化学领域。
以前，纯化少量的目的蛋白需要处理几千克的动物或植物组织，或是大量的生物体液，这个时代已经一去不返了。
对于每个研究者来说，如果他要开始一个项目，需要某种纯化的蛋白。
他马上就会想到，怎样通过重组表达的方式获得这种蛋白。
目的重组蛋白的大量表达使人们能够对其生物化学性质进行分析，将其应用于工业并发展成为商业化产品。
从理论上来讲，获得重组蛋白的过程相当直接：获得目的基因，克隆到表达载体，转入表达宿主，诱导，纯化。
然而，实际上，事情通常并不是这样。
宿主菌生长差，包涵体的形成，蛋白无活性，甚至无法获得任何蛋白，这些都是实验中会遇到的问题。
在过去，有许多综述详细地介绍了这个课题。
综合来说，这些论文收集了2000多个例子。
然而在重组蛋白表达纯化领域，一直都在进步着。
因此，在本综述中，我们对本领域最近取得的进展做了评述。
同时，对于那些那些对异源表达还不大熟练的研究人员，我们通过回答项目开始就需要解决的问题，提供的许多选择和方法，。
这些选择和方法，在过去的几十年里，曾被成功的用来表达一系列的蛋白。
问题一：选择哪种生物体作为表达宿主？整个过程的开始就是要选择宿主细胞，利用它的蛋白合成机制来获得珍贵的蛋白。
宿主的选择决定了我们以后所需要的技术，包括各种分子工具，仪器或者试剂。
在这些微生物体中，现有的宿主系统包括细菌，酵母，filamentous fungi, 和 unicellular algae。
他们各有优点和缺点，宿主的选择可能取决于我们要表达的蛋白。
例如，如果目的蛋白需要翻译后的修饰，那么我们就要选择真核表达系统。
在本篇综述里，我们主要详细介绍大肠杆菌表达系统。
众所周知，利用大肠杆菌作为宿主具有很多优点。
1.它有无可比拟的快速生长机制，在glucose-salts培养基中，以及在最优的环境条件下，它扩增一倍的时间大约是20分钟。
提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展
Vol.53,No.07. 2019DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2019.07.23提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达方法研究进展张真汪燕马振刚（重庆市动物生物学重点实验室，重庆市媒介昆虫重点实验室，重庆师范大学重庆401331）摘要大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。
通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种既高效又经济的途径。
然而，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，而在胞质中外源蛋白不易形成二硫键，出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。
文章在近年提高大肠杆菌重组蛋白可溶性表达研究的基础上，从选择适当的载体和宿主、外源蛋白与其他辅助蛋白共表达、降低蛋白合成速率、提高周质蛋白表达、融合标签表达、肽标签表达、替换蛋白质中的氨基酸、改变培养基的条件等方面进行了综述，为研究者根据外源蛋白自身特点，优化外源蛋白可溶性表达方法提供了参考。
关键词外源蛋白；可溶性表达；大肠杆菌；包涵体中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:2095-1205(2019)07-37-04 Advances in Improving the Soluble Expression of EscherichiaColi Recombinant ProteinZhang Zhen Wang Yan Ma Zhengang（Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing Key Laboratory of Vector Insects, Chongqing Normal University,Chongqing 401331）Abstract：Compared with other exogenous expression systems, escherichia coli expression system has the characteristics of high yield, easy operation, fast growth rate and low cost of recombinant protein. It is an efficient and economical way to express recombinant protein through escherichia coli. However, when expressed in escherichia coli, exogenous proteins tend to be in the cytoplasm of the reductive environment, whereas in cytoplasm, exogenous proteins are not easy to form disulfide bonds, and foreign proteins cannot fold properly, thus forming insoluble inclusion bodies. On the basis of improving the soluble expression of escherichia coli recombinant protein, the article summarized from selecting the appropriate carrier and the host, exogenous proteins are co-expressed with other helper proteins, reducing the rate of protein synthesis, improving the periplasmic protein expression, expression of fusion tag expression, peptide tag expression, replacing amino acids in a protein, changing the condition of culture medium and other aspects, providing a reference for researchers to optimize the soluble expression of exogenous proteins according to their own characteristics.Key words：exogenous proteins; soluble expression; escherichia coli; inclusion body目前大部分蛋白质功能研究需要的是可以大量纯化并且可溶的蛋白质，但不管是天然提取还是使用化学合成纯的蛋白质都是非常困难的[1]，而DNA重组技术提供了一种经济的外源蛋白获取方式。
大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展
大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展随着生物技术的不断发展和进步，外源性蛋白表达在医药、工业和生物制品等领域中扮演着越来越重要的角色。
然而，对于外源性蛋白表达的技术瓶颈和提高表达效率的研究，已成为了当前生物技术的热点领域之一。
而大肠杆菌作为一种广泛应用于分子生物学领域的微生物，也成为了外源性蛋白表达的研究热点之一。
本文将就大肠杆菌在外源性蛋白表达中的研究进展展开论述。
第一部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的特点外源性蛋白表达主要分为原核和真核系统两类。
而大肠杆菌则被广泛应用于原核系统中。
大肠杆菌在外源性蛋白表达方面的突出特点是其具有较高的表达效率和易于操作。
其表达的蛋白质具有良好的纯度和活性。
而在表达的技术方面，大肠杆菌可以利用各种载体进行转化。
同时，其遗传背景较为简单，为碱基序列仅为4.6MB的圆形染色体。
这一特点促使大肠杆菌成为了外源性蛋白表达的优选菌株。
第二部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的常用载体常用载体主要包括pUC、pET和pBAD等。
其中pUC是一种常用的负责编码外源性蛋白质的表达载体，具有高效、快速、经济等特点。
同时，pUC载体可用于亚克隆、磷酸化和DNA序列分析等相关实验。
而外源性蛋白表达的pET系列载体采用T7启动子进行表达，可以具有高效率的表达效果，还可以对靶向蛋白进行不同形式的标记，以便于在纯化时分别使用。
此外，pBAD载体也是一种经典且有效的大肠杆菌表达载体，该载体可以通过调节l-arabinose的浓度来调节目标基因的表达量。
在新型载体的研发中，通过人工合成的方法合成的RNA表达系统在蛋白表达方面也可以取得显著的进展。
第三部分：大肠杆菌在外源性蛋白表达中的最新技术1. 合成生物学的应用：近年来合成生物学在外源性蛋白表达中的应用越来越受到重视。
这项技术通过重新设计和合成生物学的元件，再结合基因表达网络及传递过程等，从而改变微生物代谢的路线，进而提高微生物的表达效率及生产能力。
重组人BMP6在大肠杆菌中可溶表达、纯化及活性分析
万方数据 万方数据 万方数据雷荣悦等：重组人ＢＭＰ６在大肠杆菌中可溶表达、纯化及活性分析４５５约占菌体总蛋白的８０％，但也是以包涵体形式存在。
改变诱导的时间和温度条件对于所诱导的目的蛋白的可溶性和产量没有什么变化（图１）。
图１ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析０．１ｍｍｏｌ，Ｉ。
ＩＰＴＧ２０。
Ｃ条件下ｐＥＴ－１５ｂ·ＢＭＰ６、ｐＥＴ－３２ａ－ＢＭＰ６转化Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）表达蛋白的溶解性Ｆｉｇ．１ＳＤＳ－Ｐ：ＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｏｌｕｂｌｅａｎｄｉｎｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｐＥＴ－１５ｂ·ＢＭＰ６．ｐＥＴ－３２ａ．ＢＭＰ６ｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍＥＣＯｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｗｉｔｈ０．１ｍｍｏＩ，ＬＩＰＴＧａｔ２０。
ＣＢＭＰ６融合蛋白含量不高，我们将ｐＭＡＬ—ｅ２Ｘ．ＢＭＰ６转化ＴＢｌ，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳结果看到与未诱导菌比较，在分子量约５７ｋＤ处出现一条明显的诱导蛋白带。
同预期ＭＢＰ—ＢＭＰ６融合蛋白大小一致。
电泳胶薄层扫描显示所表达的新蛋白约占菌体总蛋白３０％，大部分ＭＢＰ—ＢＭＰ６融合蛋白存在于上清中（图４）。
ｐＭＡＬ－ｐ２Ｘ—ＢＭＰ６转化ＥｃＤｌｉＴＢｌ分别在图３ｓＤｓ—ＰＡＧＥ分析ｐＭＡＬ‘ｐ２≥。
ＢＭＰ６表达融合蛋白２０。
＆３７。
ＣＴ，不同浓度的ＩＰＴＧ诱导表达。
由图Ｆｉｇ．３Ａｎａｌ蛐：盎嚣嚣然麓ｒｏｔ。
ｉｎｅｘｐｒｅｓ。
ｉｏｎ看到，在其它条件一定的情况下２０。
Ｃ诱导表达的ｆｒｏｍｔｈｅｐＭＡＬ－ｐ２Ｘ－ＢＭＰ６ｕｓｉｎｇＳＤＳ－－ＰＡＧＥ目标蛋白比３７。
Ｃ条件下多；融合蛋白量并不随兰篡鬈篇嚣篡：：：罢锍品筛善：：：篇．曼篇盛三ＩＰＴＧ浓度的增大而增多，０．３ｍｍｏｌ／Ｌ时诱导量就达２旷ｃ３“ｎ８０，ｂｌｃｌ竺粤。
壁ｍ。
曼ｃ？“６ｒｏ粤“誓ｔｈ８０ｎｊｃ撕ｏｎ；到最大（图２，ｌａｎｅ４）。
电泳胶薄层扫描显示融合蛋白约占菌体总蛋白５％。
大肠杆菌BL21_DE3_中表达重组蛋白的研究
摘要 为了研究在大肠杆菌 BL21 (DE3) 中重组蛋白的表达特点 ,探讨重组蛋白在大肠杆菌中表达时可溶性蛋白与包 涵体出现的特点 ,从表达载体中表达了植物 ACC 合成酶. 经 SDS2PAGE 电泳与双波长扫描分析 ,确定目的蛋白随表达 时间 、菌液密度的增加而增加. 但是其最佳表达时间为 215 h ,菌液密度 OD600 为 016 ,IPTG的最佳浓度为 016 mmolΠL ,此 时目的蛋白含量占全菌蛋白含量之比最高. 植物 ACC 合成酶在大肠杆菌中表达时以包涵体的形式存在 ,未能检测到 可溶性蛋白的表达. 关键词 ACC 合成酶 , SDS2PAGE , 包涵体 中图分类号 Q559 + . 1
责任作者 :蒋湘宁 ,男 ,1958 年生 ,教授. 主要研究方向 :植物分子生物学. Email :jiangxn @bjfu. edu. cn 工作单位 :100083 北京林业大学生 物学院森林生物学实验中心
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因此可以认为016mmollacc合成酶表达量与iptg浓度的sds2page分析泳道上方的数据为相应iptg浓度诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与细菌密度的sds2page分析011110是菌体密度为011110时诱导表达的全菌电泳图acc合成酶表达量与iptg浓度关系曲线分别为0100002010020102012014016018110acc合成酶表达量与iptg浓度的关系figuresds2pageod600acc合成酶表达量与细菌密度关系曲线acc合成酶表达量与细菌密度的关系figurebacteriadenisity215包涵体与可溶性蛋白的分析根据图沉淀与上清中都未出现明显的55kd蛋白带5a说明此时sds2page电泳未能检测到目的蛋白的表达012013诱导015od600214诱导表达量与iptg浓度的关系当菌液长到od600016时分别加入iptg37诱导培养收获细菌然后用sds2page分析011012013诱导因此可以认为对于acc合成酶用et载体在大肠杆菌中进行大量表达不会出现明显的可溶性蛋白表达
重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展
综 述重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展3郑海洲,刘晓志,宋 欣(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄 050015)摘 要 长期以来,大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统,重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N-端加工。
本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展,目的是为了提高外源蛋白的生物活性。
关键词 大肠杆菌,分泌表达,重组蛋白中图分类号:Q591.2 文献标识码:A 文章编号:100625687(2009)0420040203Advance i n the secretory expressi on of reco m b i n an t prote i n i n escher i ch i a coliZheng Haizhou,L iu Xiaozhi,S ong Xin(NCPC Ne w D rug Research and Devel opment Co.,L td,Shijiazhuang050015)ABSTRACT Escherichia coli is one of the most widely used hosts for the p r oducti on of recombinant p r oteins.Pr oducti on of secre2 t ory p r oteins in escherichia coli p r ovides several advantages over exp ressi on in the cyt op las m.Peri p las m p r ovides the oxidative en2 vir on ment t o facilitate correct disulfide bonding and p r otein folding.It als o all ows correct p r ocessing of N-ter m inal a m ino acid during secreti on.This revie w discusses recent advances in secret ory and extracellular p r oducti on of recombinant p r oteins s o as t oi m p r ove the bi ol ogical activity of the heter ol ogous p r oteins.KE Y WO RD S escherichia coli,secret ory exp ressi on,recombinant p r otein 大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点,是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统[1]。
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究
重组蛋白的高效表达及纯化技术研究随着生物技术的发展，蛋白表达与纯化技术在医疗、工业以及科学研究等领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，重组蛋白的高效表达及纯化技术是蛋白质学研究的关键环节之一。
本文旨在探讨目前被广泛应用的几种重组蛋白表达及纯化技术，以及它们的新进展与应用前景。
一、背景介绍重组蛋白指的是通过基因重组技术将人工合成的DNA片段引导到细胞中，使其在受到特定刺激后大量表达特定功能蛋白的一种新型蛋白质。
由于其具有高度专一性、易制备性以及更高的效力和安全性，越来越多的药物被开发为基于重组蛋白的生物制剂。
二、重组蛋白表达技术1. 原核表达系统原核表达系统是将DNA片段导入大肠杆菌等细菌中，在其形成菌落的过程中进行表达。
该系统的优点在于表达速度快、操作简便、表达产量高。
但同时，由于原核表达与真核细胞中的表达相比，它对于蛋白翻译辅助因子和蛋白修饰等生物特征的模拟程度较差，不利于蛋白的正确折叠，因此该系统表达的蛋白质通常需要经过重新折叠处理。
2. 原核表达系统与原核表达系统相比，真核表达系统更接近真实情况中的表达方式，对于全长的蛋白大多数时候能够实现正确的折叠。
在真核表达系统中，常用的系统包括昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌表达系统等。
其中，哺乳动物细胞表达系统能够实现高产量、高质量的蛋白质表达，因此被广泛应用于蛋白质制备。
三、重组蛋白纯化技术1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中分离出来的技术。
该技术的依据是一种特定的与目标蛋白质具有相互作用的配体分离柱。
在该技术中，目标蛋白质与配体分离柱上的特定功能团结合，非特异性的蛋白质能够在洗脱过程中被去除。
2. 总体分离法总体分离法是将目标蛋白从混合物中分离出来，采用离心、可溶性和非可溶性的分离方法。
其中，在采用可溶性分离的方式时，常用的方法有两相法、分配层析等。
四、新兴技术及应用前景近年来，3D打印技术的应用逐渐渗透到生物医疗领域，并开始用于制备组织工程器官和人造蛋白质等领域。
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
高中组11年级生物化学3人项目重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化摘要：干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。
目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。
结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。
本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。
关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化；一、研究背景干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。
其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。
干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。
它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。
其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。
在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。
二硫键氧化还原酶DsbADsbC介导重组瑞替普酶在大肠杆菌中可溶表达研究的开题报告
二硫键氧化还原酶DsbADsbC介导重组瑞替普酶在大肠杆菌中可溶表达研究的开题报告
一、研究背景
重组蛋白在生物技术研究与应用中具有广泛的应用前景。
由于原核
表达体系拥有操作简便、高效快速等优势，被广泛应用于生产大量重组
蛋白的工作中。
在大肠杆菌中，重组蛋白的可溶性表达率往往较低，这
使得其在生产和应用中的作用受到限制。
因此，如何增强大肠杆菌中重
组蛋白的可溶性表达成为了当前研究的热点问题之一。
二、研究目的
本研究旨在探究二硫键氧化还原酶DsbA和DsbC在大肠杆菌中对重组瑞替普酶可溶性表达的影响，以期为提高大肠杆菌中重组蛋白的可溶
性表达提供理论和实践依据。
三、研究内容
本研究将使用大肠杆菌作为宿主菌，构建多种表达重组瑞替普酶的
质粒，并分别将质粒转化至不同的大肠杆菌表达菌株中。
同时，设计一
系列实验，通过蛋白质表达、Western blot、蛋白纯化、SDS-PAGE、荧
光和动态光散射等方法，对重组瑞替普酶在不同宿主菌株中的表达量和
可溶性进行比较，以及分析DsbA和DsbC对其可溶性表达的影响。
最终，建立一种有效的重组蛋白可溶性表达系统，并对其应用前景进行探讨。
四、研究意义
本研究将为大肠杆菌中重组蛋白的可溶性表达提供新的思路和方法，不仅可为大规模生产高效重组蛋白提供技术支持，还为生物技术研究和
应用领域提供了新的思路和方法。
重组大肠杆菌发酵表达及代谢调控研究进展
食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期85重组大肠杆菌发酵表达及代谢调控研究进展张言慧「，高先岭「，黄魁2,郭青青「，袁建国2*(1.山东国力生物科技有限公司，山东济南250014；2.山东国力生物技术研究院，山东济南250101)摘要：作为应用最为普遍的蛋白质表达系统，重组大肠杆菌表达系统具有其他表达系统无法比拟的优越性。
本文综述了大肠杆菌作为表达系统的特征，釆用重组大肠杆菌表达的重组蛋白及生物化学产品概况，概述了表达载体中营养源诱导启动子、温敏型启动子及乳糖启动子3种不同类型启动子特点。
另外分析了不同大肠杆菌宿主对碳源的代谢特征，乙酸代谢对大肠杆菌生长及重组蛋白表达的影响，丙酮酸代谢及乙醛酸循环的特征，最后介绍了发酵过程调控对重组大肠杆菌表达系统的影响。
关键词：大肠杆菌；发酵；代谢；启动子；重组蛋白中图分类号：Q939.97文献标识码：A文章编号：1672-979X(2021)01-0085-07DOI：10.3969/j.issn.l672-979X.2021.01.018Research Progress on Fermentation Expression and Metabolism Regulation of RecombinantEscherichia ColiZHANG Yan-hui1,GAO Xian-ling1,HUANG Kui2,GUO Qing-qing1,YUAN Jian-guo2收稿日期：2020-10-29基金项目：山东省重大科技创新工程项目(2019JZZY010520)作者简介：张言慧，硕士，工程师，研究方向为微生物发酵过程优化"通讯作者：袁建国，研究员，研究方向为食品与药品生物技术E-mail:******************collagen-induced arthritis[J].Arthritis Rheum,2000,43(8):16981709.[36]Sadallah S,Lach E,Lutz H U,et al.CD35IN synovial fluid frompatients with inflammatory joint diseases[J].Arthritis Rheum, 1997,40(3):520-526.[37]Nilsson S C,Sim R B,Lea S M,et plement factor I inhealth and disease[J].Mol Immunol,2011,48(14):1611-1620. [38]Mastellos D C,Ricklin D,Yancopoulou D,et plementin paroxysmal nocturnal hemoglobinuria:exploiting our current knowledge to improve the treatment landscape[J].Expert Rev Hematol,2014,7(5):583-598.[39]SjOberg A P,Manderson G A,Morgelin M,et al.Short leucine-richglycoproteins of the extracellular matrix display diverse patterns of complement interaction and activation[J].Mol Immunol,2008, 46(5):830-839.[40]Banda N K,Levitt B,Glogowska M J,et al.Targeted inhibitionof the complement alternative pathway with complement receptor 2and factor H attenuates collagen antibody-induced arthritis in mice[J].J Immunol,2009,183(9):5928-5937.[41]Song H,He C,Knaak C,et plement receptor2-mediatedtargeting of complement inhibitors to sites of complement activation[J].J Clin Investig,2003,111(12):1875-1885.[42]Molina H.Distinct receptor and regulatory properties ofrecombinant mouse complement receptor1(CR1)and Crry,the two genetic homologues of human CR1[J].J Exp Med,1992, 175(1):121-129.[43]Michelfelder S,Fischer F,Waldin A,et al.The MFHR1FusionProtein Is a Novel Synthetic Multitarget Complement Inhibitor with Therapeutic Potential[J].J Am Soc Nephrol,2018,29(4): 1141-1153.[44]Noris M,Remuzzi G.Glomerular diseases dependent oncomplement activation,incl-uding atypical hemolytic uremic syndrome,membranoproliferative glomerulonephritis,and C3 glomerulopathy:core curriculum2015[J].Am J Kidney Dis,2015, 66(2):359-375.[45]Melis J PM,Strumane K,Ruuls S R,et plement in therapyand disease:Regul-ating the complement system with antibodybased therapeutics[J].Mol Immunol,2015,67(2):117-130.86食品与药品Food and Drug2021年第23卷第1期(1.Shandong Guoli Biotechnology Limited Company,Jinan250014,China；2.Shandong Guoli BiotechnologyResearch Institute,Jinan250101,China)Abstract:As the most widely used protein expression system,the recombinant Escherichia coli expression system has more advantages than other expression systems.In this paper,the characteristics of Escherichia coli as an expression system were reviewed,and recombinant proteins and biochemical products expressed in recombinant Escherichia coli were introduced.The characteristics of three different types of promoters including nutrition-induced promoters, temperature-sensitive promoters and lactose promoters in expression vectors were summarized.In addition,the metabolic characteristics of carbon sources in different Escherichia coli hosts,the eflect of acetic acid metabolism on the growth of Escherichia coli and expression of recombinant protein,the characteristics of pyruvate metabolism and glyoxylic acid cycle were analyzed.Finally,the effect of fermentation regulation on the expression system of recombinant Escherichia coli was introduced.Key Words:Escherichia coli;fermentation;metabolism;promoter;recombinant protein由于大肠杆菌遗传学背景较清楚，生长速度快，培养基条件要求较低，容易实现高密度培养等特点，长期以来是商业生产重要目的基因的表达系统为了获得高水平的基因表达产物，综合考虑控制转录、翻译、蛋白质稳定性及向胞外分泌等多方面因素，设计了许多具有不同特点的表达载体，以满足表达不同性质、不同要求的目的蛋白需要冈。
大肠杆菌重组蛋白表达存在的问题
大肠杆菌重组蛋白表达存在的问题一、概述大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于土壤和水中的革兰氏阴性细菌，是重要的生物工程表达系统。
大肠杆菌重组蛋白表达系统因其高效、简便和成本低廉而被广泛应用于生物制药、基因工程和研究领域。
然而，大肠杆菌重组蛋白表达过程中存在一系列问题，限制了其在实际应用中的发展。
二、表达负荷过大在大肠杆菌重组蛋白表达系统中，由于外源基因的表达和蛋白质合成会对细胞的正常代谢和生理过程造成负担，因此表达负荷过大是一个常见问题。
这会导致目的蛋白无法高效表达，或者甚至导致细胞逝去，影响蛋白表达的稳定性和可靠性。
三、蛋白质结构错误大肠杆菌重组蛋白表达系统中，外源基因的表达受到诸多因素的影响，例如启动子的选择、转录水平、翻译后修饰等，这些都可能导致目的蛋白结构错误。
蛋白质结构错误会降低蛋白活性和稳定性，影响其在实际应用中的效果。
四、蛋白质纯度较低在大肠杆菌重组蛋白表达系统中，外源基因的表达会导致大量的杂蛋白和热蛋白的产生，这些都会降低目的蛋白的纯度。
低纯度的蛋白在实际应用中无法满足质量标准，限制了其广泛应用。
五、蛋白聚集和包含体形成在大肠杆菌重组蛋白表达系统中，外源基因的表达会导致蛋白聚集和包含体形成，这些都会影响蛋白的溶解性和稳定性。
蛋白聚集和包含体形成是影响大肠杆菌重组蛋白表达系统应用的重要问题之一。
六、表达宿主毒性外源基因的表达可能会产生毒性蛋白，例如膜蛋白、毒素等，这些都会对大肠杆菌宿主细胞产生毒性作用，甚至导致细胞逝去。
表达宿主毒性的问题不仅影响了目的蛋白的表达效率，还可能对表达宿主细胞的健康造成影响。
七、解决方案及展望针对以上存在的问题，研究人员提出了一系列解决方案。
例如通过优化启动子和调整转录水平，减轻表达宿主的负荷；设计合适的蛋白结构域，提高蛋白质结构的稳定性；采用亲和纯化技术和蛋白纯化缓冲液，提高蛋白质的纯度；利用融合蛋白和分子筛等技术，降低蛋白聚集和包含体的形成；通过调整表达条件和优化表达宿主，减轻表达宿主的毒性等。
大肠杆菌系统中表达重组蛋白的策略研究
中山大学硕士学位论文大肠杆菌系统中表达重组蛋白的策略研究姓名：区景行申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：徐安龙20040601太肠杆菌系统中表达重组蛋白的策略研究摘要大肠杆菌重组蛋白表达系统，如近年来的ＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）（ｐＥＴ）系列，是制备许多重组功能蛋白的首要选择。
对大肠杆菌中表达重组蛋白的策略进行优化，不但有应用上的意义，也能为以大肠杆菌为模型进行细胞代谢、基因调控、蛋白折叠和转运等方面的研究提供新的素材，因此具有重大的意义。
本文以大肠杆菌ＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）（ｐＥＴ）、ＤＨ５ｑ（ｐＧＥＸ）和ＴＧＩ（ｐＢＶ２２０）系统为对象，研究了十数种异源于大肠杆菌的基因在这些系统中，各种培养条件下进行胞内表达的情况．提出了与常规对数期表达策略截然不同的静止期表达策略。
用该种改进策略对目的基因进行诱导表达，不但能获得产量更高更稳定的目的重组蛋白，而且提高了表达质粒的稳定性，还能减少抗生素的使用并提高菌体对培养基中营养物质的利用率．对大肠杆菌系统在工业或制药规模上制备重组蛋白的工艺的摸索有较大的参考价值。
蛋白质的跨膜转运作为一种基本的细胞生理活动，是近年来分子生物学研究的热点和难点，更有其应用上的重要意义。
一般认为大肠杆菌对蛋白转运的效率不高，而且蛋白一般被转运至细胞内外膜之间的周质空间（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）。
另一方面，人类胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂（ｈｕｍａｎｐａｎｃｒｅａｔｉｃｓｅｃｒｅｔｏｒｙｔｒｙｐｓｉｎｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ＰＳＴＩ）由５６个氨基酸构成，具有治疗胰腺炎等功效，过往有研究报道在大肠杆菌中分泌表达，切割信号肽后的成熟蛋白能直接透过大肠杆菌的外膜分泌到培养基上清中，有利于纯化和活性检测。
然而重组ＰＳＴＩ无论是在大肠杆菌还是在酵母、肿瘤细胞等表达系统中的得率都比较低。
因此，以ＰＳＴＩ为模型研究其在大肠杆菌和酵母中的跨膜转运有其深远的理论研究及实际应用价值。
本论文介绍了基于大肠杆菌ＢＬ２Ｉ（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ）的ＰＳＴ［表达系统的构建和目的蛋白分泌表达的研究，并在培养物上清中获得了活性成分。
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收稿日期：２００７—１０—１７：修回日期：２００７一１２—２０ 基金项目：国家科技攻关重大项目（２００４ＢＡ９０１Ａ０３）ｉ教育部 “新世纪优秀人才支持计划”项目（ＮＣＥＴ一０４一０９０６）；四川 省基础研究项目（０５ＪＹ０２９—１０９，２００６Ｊ１３—０４８）；四川省重点 建设学科项目（ＳＺＤ０４１８） 作者简介：余波（１９８１一），男，硕士． 通讯作者：程安春（１９６５一），男（布依族），教授，博士，博士生 导师；汪铭书（１９６４一），女（苗族），教授，博士，博士生导师．
一个依赖Ａ即的过程帮助蛋白正确折叠。研究发
现，与分子伴侣共表达可提高目的蛋白的可溶性，并 且如将几种分子伴侣同时表达，有可能获得比单独使 用更好的效果。值得一提的是，共表达分子伴侣的选 择应根据重组蛋白自身的特点进行。吴小阳等人将 ＥＲＲＣＣｌ基因与大肠杆菌ＧｒｏＥＬ—ＥＳ进行共表达。 结果表明，ＧｒｏＥＬ—ＥＳ不能改善ＥＲＲＣＣｌ基因在大 肠杆菌中的可溶性。还有一个需要考虑的是培养温 度，温度可能会对共表达分子伴侣的效果产生重要的 影响。Ｈａｎ
［３］
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时，需要将各种方法有机地结合起来。另外，转基因 植物的食用安全性问题一直是全球争论的焦点，由于 利用转基因植物表达的疫苗不属于转基因食品的范 畴，人们对此必然会产生疑虑甚至排斥。对于利用转 基因植物表达动物疫苗的研究可先行一步，待其形成
成熟、稳定的产业化体系后，再实现在人类疾病预防
方面的应用。已有的研究结果表明，对于猪的各类胃 肠道传染病，率先投放使用的可能性很大。科学家们 也开始着手关于植物表达其他猪疫苗乃至寄生虫疫 苗的研究。相信在不久的将来，利用转基因植物表达 的疫苗会成为防制各类猪疾病的强而有力的工具。 参考文献：
Ｍ
Ｘ等人将内皮他丁基因与分子伴侣
ＧｒｏＥＬ—ＥＳ或ＤｎａＫ—ＤｎａＪ—ＧｒｐＥ共表达，并在 １６℃条件下培养，结果可溶性蛋白的表达量增加。 ＤｓｂＡ是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与 新生蛋白质折叠过程的催化二硫键形成的折叠酶。 ＤｓｂＡ无论是在体内与目标蛋白融合表达还是在体外 以折叠酶形式添加，都能有效地催化蛋白质的折叠， 同时ＤｓｂＡ还具有部分分子伴侣的活性。真核细胞 的二硫键异构酶（ＰＤＩ）也是一种常用的折叠酶。ＰＤＩ 不仅是催化半胱氨酸氧化、二硫键异构化的高效酶， 而且还具有分子伴侣的活性。 ２．５通过替换氨基酸增加町溶性 蛋白质的一级结构即氨基酸序列，是影响包涵体 形成的一个重要冈素。将蛋白质中的某个或几个氨 基酸进行替换，可抑制包涵体形成，增加表达产物的
万方数据
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ
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Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
№１ ０
２００８
时，容易被宿主本身表达的蛋白酶降解。因此，选择 蛋白酶缺失的宿主菌非常有利于重组蛋白的表达，尤 其是重组蛋白的可溶性表达，ＢＬ２１（ＤＥ３）是最常用 的表达菌。Ｉｇｎａｔｏｖａ Ｚ等人用ＢＬ２１（ＤＥ３）作为重组 青霉素酰胺酶的表达宿主菌，结果比其他宿主菌的可 溶性表达量高。重组蛋白在细菌细胞质中不能正确 折叠的原因是大肠杆菌的细胞质呈还原环境，不利于 二硫键的形成。针对大肠杆菌的还原环境，研究人员 构建了缺失硫氧还蛋白还原酶基冈的硫氧还蛋白还 原酶缺陷株细菌，降低细胞质还原状态，以利于二硫 键形成。如选用谷胱甘肽还原酶（ｇｏｒ）突变的菌株或 硫氧还蛋白还原酶（ｔｒｘＢ）突变的菌株，将有助于制造 次还原细胞质环境，进而利于二硫键的形成。还有研 究表明，把合成外膜元件的基因突变菌株引到重组蛋 白的表达中，这样既可产生可溶性的具有正确空间结 构的活性蛋白，还可避免细胞壁在重组蛋白跨膜转运 中的阻碍作用。如将Ｌ型细菌（缺少细胞壁和胞周 质）作为青霉素酰基转移酶的表达宿主菌。 ２．２降低童组蛋白合成的速率 蛋白质动力学模型研究表明，活性蛋白的产率取 决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的 速率。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超 过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。因此，降 低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶 性表达。常用的方法有降低培养温度、选择适当的启 动子、使用较低浓度的诱导剂。降低培养温度有利于 重组蛋白合成速率的降低，因为在低温条件下细菌生 长缓慢，蛋白质合成也相应较慢，新合成的蛋白质会 有更充分的时间折叠。同时降低培养温度也能降低 重组蛋白降解的速率，提高重组蛋白的稳定性。降低 培养温度虽能增加外源蛋白的可溶性，但也有一个下 限，一般为８～１０ ｃｃ，低于此温度，大肠杆菌将停止 生长，蛋白也基本停止表达。 目前，有许多启动子被应用于重组蛋白的表达， 启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导 性及经济因素等方面考虑。在胞内表达中，常采用 ，１７、ＰＬ等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的 １０％一７０％，重组蛋白多以包涵体形式存在。因此， 常采用强度较弱的ｌａｃ等启动子以达到一个与表达 能力相匹配的翻译速率。 ２．３改变培养基成分 培养基的组成对提高大肠杆菌中重组蛋白可溶 性表达有显著影响。首先，保持培养基ｐＨ值的稳定 性对可溶蛋白的表达将产生重要影响，需根据菌体和 重组蛋白的特点选择合适的ｐＨ值。ｐＨ值距重组蛋 白等电点越远，表达的蛋白产物就越不容易形成包涵 体。其次，加入一些化学物质将对重组蛋白的可溶性 表达有很大的提高，如一些非代谢性糖类、甘氨酸、
ＴｒｉｔｏｎＸ一１００、乙醇等。由于一些非代谢性糖类如山 梨糖醇、多元醇、蔗糖、甜菜碱的存在会增加培养基 的渗透压，进而可导致细胞质内渗透压防护剂的积 累，如甘氨酰一三甲铵乙内酯能抑制细胞质中重组蛋 白的聚集，从而提高可溶性蛋白的表达水平。 为了增加外膜的通透性，研究者在培养基中添加 了甘氨酸、ＴｒｉｔｏｎＸ一１００，这两种物质均能破坏细胞外 膜的完整性，改变细胞外膜的通透性，且不引起明显 的细菌裂解。唐金宝等人在培养基中添加终浓度为 １％的Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ一１００及１％的甘氨酸，可使ＰｒｏＺＺ— ＥＧＦＰ基因在培养液中的可溶性表达量提高６倍。 另外，杨军兰等人在培养基中加入乙醇，能够抑 制结核分枝杆菌Ｍｒ３８０００蛋白在大肠杆菌表达时的 聚集，促进其正确折卺形成可溶蛋白。由于乙醇是大 肠杆菌热休克反应最强的诱导剂之一，所以它在转录 水平上刺激ＤｎａＫＪ上调，通过诱导ＤｎａＫ和ＤｎａＪ蛋 白的表达促进重组蛋白的可溶性表达。
［１］ＢＡＲＲＹ Ｊ Ｌ，ＪＯＳＥＰＨ
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万方数据
《黑龙江畜牧兽医）２００８年第１０期
２１
动物麻醉的研究进展
胡崇伟，于
枫，李
静，刘晓刚，付彦涛，高
利
（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０） 中图分类号：￥８５７．１２＋４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４—７０３４（２００８）１０—００２１—０２ 的安全性更高、苏醒更快，成为新一代吸人麻醉药的 代表。 １．２静脉麻醉 １Байду номын сангаас７２年，Ｇｒｅ曾用水合氯醛静脉注射作全身麻 醉；１９０３年，Ｆｉｓｃｈｅｒ和Ｍｅｆｎｇ合成巴比妥；１９０９年， Ｂｉｅｒ用普鲁卡因作静脉麻醉产生镇痛作用；１９３２年， Ｌｕｎｄｙ报道用硫喷妥钠作静脉麻醉；以后相继出现普 尔安、羟丁酸钠、二甲基苯胺嚷嗪、氯胺酮、乙醚脂、异 丙酚等静脉注射的全身麻醉药。１９０８年，在动物临 床上将水合氯醛应用于马；２０世纪３０年代，又将巴 比妥应用于犬和猫。目前，临床研究得较多的麻醉药 物是氯胺酮、巴比妥类药、ｄ：受体激动剂和阿片受体 类药，并探索出一些较好的麻醉组合，也取得了较满 意的麻醉效果。 １．３复合麻醉 复合麻醉是指同时或先后应用两种或两种以上 的麻醉药物、麻醉方法及麻醉疗法的临床麻醉技术， 以达到满意的术中及术后镇痛效果，为外科手术创造 良好的条件，确保病人或动物的安全和术后的顺利康 复。其优点在于：麻醉用药剂量减少；减少药物的不 良反应；满足手术操作的要求；将麻醉对机体的不良 反应降至最低程度；提供完善的术后镇痛。 复合麻醉可分为吸人复合麻醉、静脉复合麻醉、
２．４
与分子伴侣或折叠酶共表达 分子伴侣是一类能帮助多肽链形成正确三维结
构的蛋白质，它主要通过阻止或校正出现不合理的疏 水结合来帮助肽链的折叠。大肠杆菌的分子伴侣是 由２个类型的蛋白质构成的，分别是６０ ｋｕ的Ｈｓｐ６０ 蛋白和１０ ｋｕ的Ｈｓｐｌ０蛋白，二者都包含疏水区域， 这些区域可与未折叠或错误折叠的多肽链结合，经过
外３个部分。根据表达部位的不同可将蛋白在大肠
２．１选择适合的载体与宿主菌 选用合适的载体与菌株结合可明显提高目的蛋 白可溶部分的比例及活性。研究者通过在载体上融 合一些自身溶解性高的多肽序列（或一些催化二硫 键形成的酶）和把信号肽序列引入表达载体来提高 重组蛋白的溶解性或正确折叠。 重组蛋白在大肠杆菌细胞质或细胞周质中表达