红曲霉发酵制备洛伐他丁

洛伐他汀分析检测方法
硅胶薄层层析法测定（TLC） 毛宁等通过实验发现，若用发酵滤液粗提浓缩物， 最终提取结晶以及结晶剩下的滤液点样， 用薄层层析检测 结果几乎一致，因此只需对发酵滤液粗提的浓缩物进行薄 层层析定量或定 性检测。 TLC定性试验 取硅胶GH25420g，加0.5%CMC Na50ml，用铺板器铺成1mm厚， 20cm×20cm的薄层板，室 温晾干，105℃活化1h，置干燥器中备用。展开剂：二氯甲 烷 ：丙酮（9：1），称取固态样品5g，用100ml乙酸乙酯在索氏提 取器上回流提取1h， 提取液浓缩至5ml，取50μl点样，或直 接取发酵滤液粗提浓缩物50μl点样，同时用 Monacolin K标 准品（美国Merch公司）点样作对照，展开15cm，取出晾 干，紫外灯 下观察斑点位置。Monacolin KRf值应为0.47，分 别挖取与标酸乙酯5ml，剧烈振荡 2min， 2000r/min离心15min，取上清液低温蒸干，加5ml环已 烷重新溶解，观察在200～ 300nm范围内的紫外吸收图谱， Monacolin K在231nm，238nm及247nm下有特征吸 收峰。
1.优化培养基组成促进红曲洛伐他汀的合成 以提高红曲洛伐他汀产量为目的改良红曲霉发酵培养基成分主要存在两种途径，其中普 遍采用以大米为主的发酵基质，重点研究发酵工业中作为添加剂的碳源、氮源、无机盐 等营养因子对红曲霉发酵生产洛伐他汀的影响，及以何种比例添加最为合适。另一种途 径则突破传统，寻求比大米更适合红曲霉发酵生产洛伐他汀及其他功能性物质的替代
样品预处理对于减少色素在桔霉素测定中的干扰亦很重要。许赣荣等以甲苯-乙酸乙 酯-甲酸（7:3:1）为提取溶剂，将红曲样品超声波提取 3 次后，桔霉素的提取效率最 高，同时提取的红曲色素最少，为准确检测功能性红曲中的微量桔霉素提供了较好 的样品预处理方法。
提高红曲洛伐他汀产量的途径
目前，对于如何提高红曲洛伐他汀产量的研究主要集中在红曲霉发酵工艺的改进和红曲 霉菌种的改良两个层面。
国内外工业化生产状况
1987年美国开发新一代降胆固醇药物--美降之投放 市场，并于1989年进入中国，随 后美国开发了vastatin系列 降胆固醇药物，其主要成分就是Monacolin K或J。受日 本、美国研究工作和中国历代对红曲药用功效的启示，1991 年，张茂良等人开始了 对红曲的研究。1995年开发出新 型天然降血脂药物--血脂康，该药利用红曲发酵后 的综 合提取物制成，未对发酵产物进行提纯，除含有降胆固醇物 质Monacolin K外， 还保留其他多种有效成分。同年，中 国科学院成都地奥制药公司生产的脂必妥片， 是一种新型 的中成药，主要成分是红米曲。近年来，高血脂以及相 关的心血管疾病 已成为影响我国人民身体健康的主要疾病 之一，全国血脂偏高的病人高达8000万人， 引起这些疾病 的主要因素是高胆固醇，对含Plonacolin K类药物目前我国 刚开始生 产，在产率和提取得率上与发达国家有较大的差 距，而且副作用普遍反映较大，此 类药品主要靠进口，价格 较贵，如美国生产的Lovostatin，年销售额高达20亿美元。 因此，加大对Monacolin K的研究开发具有重要的现实意义。
结果： 洛伐他汀在5~50μg/mL质量浓度范围内与 峰面积线性关系良好,加样平均回收率为100. 75%,RSD为0. 87%。 本方法简便有效,重复性好,可作为红曲霉相 关产品的质量控制方法。
红曲中的 Monacolin K 以两种形式同时存在，即闭环的内酯式结构和开环的酸式结 构。随着红曲生产加工过程中干燥程度的逐渐增加，酸式结构的Monacolin K 逐渐 脱水向内酯式结构转化，因此，生产加工工艺不同，产品中两种结构成分的含量也 不尽相同。目前，红曲中 Monacolin K 的 HPLC 检测方法多采用美国药典中土曲 霉内酯式洛伐他丁的检测方法，事实上仅适用于检测红曲中的内酯式 MonacolinK。 罗仁才等用 NaOH 将红曲样品碱化处理，使内酯式 Monacolin K 全部转化为酸式 结构，以 HPLC 法测定了红曲中 Monacolin K 的总量。
红曲生产工艺流程可分为3个部分，分别制得3个产品：1.红曲发酵制得原料精； 2.红曲原粉灌装制造胶囊；3.原料粉加工成洛伐他汀原料粉。
固态发酵法
分离与提取
取发酵液过滤，滤液用6mol/L盐酸调pH至3.0后，用 醋酸乙酯充分抽提，抽提液用 5%NaHCO3洗涤，经无水硫酸 钠干燥后，于50℃减压浓缩，得到粗提浓缩物，溶 于苯中，滤 液用5%碳酸氢钠洗净，与2mol/L氢氧化钠混合，置室温下 搅拌2h，收 集含水层，并用6mol/L盐酸调pH至3.0，再用醋 酸乙酯提取2次，收集溶剂蒸发至 干，得油状物质溶于少量 苯中，室温静置后过滤，得到无色Monacolin K结晶。 固态发酵中，将所取样品碾碎，加入一定体积的乙 醇溶液，用超声波处理20min， 浸泡过夜，过滤，滤液处理同 上。
HPLC定性加定量检测 高嘉安等用高效液相色谱仪检测粗提浓缩物，出现多个杂质峰，它们的位置远离 Monacolin K峰，对测量值没有 影响，因此只需对发酵液的粗提浓缩物进行检测。所 用仪 器为Beckman126型高效液相层析仪，分离管为0.76cm× 30cm，C18μm Bondapak微径管柱，流动相为79%甲醇和21% 磷酸，流速1ml/min，紫外检测波长： 237nm，标准品同上。 如何对发酵样品进行简便有效的预处理是定量分析的一个关键问题。 发酵液的预处理方法:取6mL发酵液,加入14mL甲醇,摇床振荡(30℃,200rpm)2.5一3h后, 离心(8000r/min)20min,上清液用有机滤膜过滤后进样。
TLC定量分析 精密称取标样适量，加乙酸乙酯 配成1ml含10mg的溶液，精密吸取该液5， 10，15，20，25μl点 于薄层板上，展开，分别刮取Monacolin K斑点和相同面积的 空白 硅胶，按以上制成环乙烷溶液，在247nm下测定光密 度。标准样的微克数与光密度分别 为横，纵坐标作标准曲 线。按以上将样品提取液50μl点于同一板上，将斑点取 下制成环 乙烷溶液测定光密度，根据光密度从标准曲线上 查得对应的Monacolin K的μg数。
发酵过程中易产生的毒性物质桔霉素 （citrinin）
在红曲霉发酵晚期，易产生次级代谢产物桔霉素，桔霉 素是毒性很强的真菌毒素， 对肾脏有毒害作用，而且还发现 有致畸作用，但并非所有的红曲菌都会产生桔霉素， 例 如；日本用从毛红曲霉，红色红曲霉，单色红曲霉可以生产出不含桔霉素的产品， 而且桔霉素的产生与否与生产方 法有关，生产工艺条件还决定桔霉素的含量，例如 许赣荣 等筛选得到数株低产桔霉素的红曲菌种。由此看来，只 要筛选出合适的菌种 并优化发酵工艺，使桔霉素的产生受 到抑制，得到高的Monacolin K含量而且不含 或少含桔霉素 的红曲产品是可能实现的。也有人认为红曲霉发酵产品是 一种混合物， 不能认为因为其中存在桔霉素，就否定红曲制 药的正常作用，其剂量本来就小，在 一定的范围内，人体食用仍然是安全的。
2.利用原生质体融合技术改良红曲霉菌种 原生质体融合技术广泛应用于微生物育种，具有遗传信息传递量大、可实现远缘杂交、 定向选择亲株、操作方便等优点。 3.应用基因工程技术构建高产洛伐他汀的红曲霉菌株 对于红曲洛伐他汀生物合成相关基因和酶的研究有利于深入理解红曲洛伐他汀的生物合 成途径，为应用基因工程技术定向选育高产洛伐他汀的红曲霉菌株提供了基础理论和技 术手段。此外，通过基因改造获得高产洛伐他汀的土曲霉菌株的成功经验可为红曲霉相 关研究的开展提供很好的借鉴。
品。
2.发酵方式和条件对红曲洛伐他汀合成的影响因素 固体发酵与液体发酵的选择.温度.物料的初始含水量.物料厚度. 翻曲.光照.超声波.两种 红曲霉共同进行固体发酵。
提高红曲霉生产洛伐他汀的能力
菌种是发酵工业的灵魂，选育性能优良的菌种是大规模高效、高质生产的前提和关 键。对于功能性红曲产品的生产来说，自然筛选的红曲霉菌种通常需要进行菌种改 良以获得高产洛伐他汀的红曲霉菌株。目前，菌种改良的常用手段包括诱变、遗传 重组和基因工程技术。 1.诱变育种筛选高产洛伐他汀的红曲霉菌株 诱变是最常用的菌种改良手段，外界的高能量射线或诱变剂可使细胞的遗传物质发 生改变，引起基因的重排，进而改变细胞的代谢途径，有望培育出遗传稳定的高产 菌株。 新型的诱变方法如激光、离子注入、空间诱变等也已应用于红曲霉的菌种改良中。
优化发酵工艺提高红曲洛伐他汀的产量
如今，红曲行业普遍采用的发酵工艺主要有两种，一种是液体深层发酵，主要用于生产 水溶性的红曲红色素；另一种是液-固两步发酵法，即先制备液体种曲，后采用固体发 酵培养，红曲米粉及功能性红曲的生产则主要采用此种发酵方式。大量研究表明，针对 不同的红曲霉菌株，采用各种优化的培养条件，能够有效提高红曲洛伐他汀的产量。
桔霉素的检测
目前红曲中桔霉素的检测方法主要有 HPLC-紫外检测法、HPLC-荧光检测法、酶免 疫法等。紫外检测的最低检测浓度通常为 1mg/ml，而荧光检测的最低检测限可达 0.60ng，更适用于功能性红曲中微量桔霉素的检测。酶免疫法测定桔霉素灵敏度亦 较高，但所需试剂价格昂贵，未能普及应用。
RP-HPLC-PDA检测器测定功能红曲中 Monacolin化合物含量
为了能够在缺乏Monacolin化合物标准样品的情况下对功能红曲中Monacolin类化合物 进行定性、定量分析，建立了用RP-HPLC-PDA检测器测定功能红曲中Monacolin类化合 物总含量的检测方法。 用75%乙醇超声提取功能红曲中的Monacolin类化合物，高效液相色谱仪以甲醇∶水∶ 磷酸=385∶115∶0.14（v∶v∶v）为流动相，用反相C18柱（4.6×250mm，5μm）分 离提取液中的Monacolin类化合物，并用二极管阵列检测器检测。在得到的色谱流出曲 线图上，根据标准Monacolin K（内酯型或酸式）保留时间和Monacolin类化合物特征 吸收光谱定性。 以波长238nm处的色谱图为定量依据，将样品中Monacolin 组分峰面 积之和与标准Monacolin K（内酯型或酸式）色谱峰面积比较定量。 在此实验条件下，功能红曲提取液中各Monacolin类化合物能够得到良好地分离。用检 测器同时给出的各Monacolin类化合物紫外吸收光谱图定性，用外标法根据Monacolin 类化合物峰面积定量。对方法的准确度、精密度、线性关系进行考察；对功能红曲样品 进行检测均取得良好结果。 Monacolin K 的检测方法还包括：紫外分光光度法、超临界流体色谱法等。