A549DDP细胞凋亡与其机制的研究

A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究1材料

1.1主要仪器

荧光显微镜及照相系统：Olympus公司

垂直电泳槽：Bio-Rad公司

电转移槽：Bio-Rad公司

恒温摇床：江苏太仓仪器公司

分光光度仪：Bio-Rad公司

遥控酶标仪：TECAN公司

台式高速离心机：eppendorf公司

其余同前两部分

1.2普通耗材

50mL/250mL细胞培养瓶：Nunc公司

6孔细胞培养板：Costar公司

60mm细胞培养皿：Costar公司

细胞刮刀：Nunc公司

1.3主要试剂

Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司

PI和Annexin V-FITC：美国BD公司

TUNEL试剂盒：罗氏公司

鼠抗人Caspase-8 p10单抗：Cell Signaling

HRP标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司

BCA法蛋白定量试剂盒：Pierce公司

ECL发光检测试剂盒：Pierce公司

硝酸纤维素转移膜(0.22μm)Amersham公司DAB北京中杉公司

其余试剂同前两部分

1.4常用缓冲液及培养基

结合缓冲液(×10)：

100 mmol/L HEPES(PH 7.5)

1.4 moL NaCl

25 mmol/L CaCl2

单去圬剂裂解液：

50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)

150 mmol/L NaCl

1%TritonX-100

100 g/mL PMSF

5×SDS蛋白上样缓冲液：

250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8)

10%SDS

50%甘油

0.5%溴酚蓝

500 mmol/L DTT(临用前现加)

电泳缓冲液：

25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 250 mmol/L甘氨酸(PH 8.3) 0.1%SDS

转移缓冲液：

5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 120 mmol/L甘氨酸

0.1%SDS

20%甲醇(V/V)

储存于4℃备用

PBS缓冲液

137 mmol/L NaCl

2.7 mmol/L KCl

10.0 mmol/L Na2HPO4

2.0 mmol/L KH2PO4

调节至PH=7.4

洗涤缓冲液(PBS-Tween-20)：1000 mL PBS(PH7.4,0.01M) 500μL Tween-20

封闭缓冲液：

5 g脱脂奶粉

100 mL PBST

1.5细胞系

同第一部分

2方法

2.1 A549/DDP细胞凋亡的检测

2.1.1细胞凋亡形态学观察

将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1×104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液继续培养24 h后终止培养，取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分钟。

②去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

③加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动数次。

④去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。

⑥上荧光显微镜观察，激发波长350nm，发射波长460nm。

2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色

同上方法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL 试剂盒说明书操作。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，

固定30分钟。

②PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液)，室温孵育30分钟。

③同上用PBS洗片，滴加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中)，在冰浴中孵育2分钟。

④PBS洗两次，滴加50μL的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育60分钟。

⑤PBS洗两次，滴加50μL的转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30分钟。

⑥PBS洗两次，加入DAB底物溶液，室温孵育10分钟。

⑦PBS洗两次，封片。光镜下观察。

⑧结果判定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。每张片至少观察500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数(apoptotic index,AI)。

2.1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡

①取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。

②接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。

③次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。

④常规消化，4℃离心(800rpm,5min)，收获各组细胞，转移至1.5mL

离心管。

⑤弃上清，加入预冷的1×结合缓冲液100μL，重悬细胞，置于冰浴。

⑥加入5μL Annex in V-FITC和5μL PI于细胞悬液中，混匀，4℃避光染色10min。

⑦补加490μL结合缓冲液混悬细胞，立即行FCM分析。

2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8的影响

取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液，接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。

2.2.1样品制备

①提取细胞总蛋白：

a.培养液中悬浮细胞蛋白的提取：各浓度姜黄素处理细胞24h后，终止培养。将培养皿中的培养液转移至15mL塑料离心管中，4℃，2500rpm离心10min，弃上清，4℃1×PBS洗涤两次，加入单去污剂裂解液100μL于冰上裂解30min，将上清转移至1.5mL塑料离心管，备用；

b.贴于培养皿上细胞蛋白的提取：4℃1×PBS洗涤培养皿两遍，加入单去污剂裂解液300μL于冰上裂解30min。裂解完毕后，用细胞刮片将细胞刮于一侧，转移至1.5mL塑料离心管中，4℃，12000rpm离心10min。

c.将离心后的上清液与从a中得到的裂解上清混合，4℃，12000rpm