A549DDP细胞凋亡与其机制的研究

A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究1材料1.1主要仪器荧光显微镜及照相系统：Olympus公司垂直电泳槽：Bio-Rad公司电转移槽：Bio-Rad公司恒温摇床：江苏太仓仪器公司分光光度仪：Bio-Rad公司遥控酶标仪：TECAN公司台式高速离心机：eppendorf公司其余同前两部分1.2普通耗材50mL/250mL细胞培养瓶：Nunc公司6孔细胞培养板：Costar公司60mm细胞培养皿：Costar公司细胞刮刀：Nunc公司1.3主要试剂Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司PI和Annexin V-FITC：美国BD公司TUNEL试剂盒：罗氏公司鼠抗人Caspase-8 p10单抗：Cell SignalingHRP标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司BCA法蛋白定量试剂盒：Pierce公司ECL发光检测试剂盒：Pierce公司硝酸纤维素转移膜(0.22μm)Amersham公司DAB北京中杉公司其余试剂同前两部分1.4常用缓冲液及培养基结合缓冲液(×10)：100 mmol/L HEPES(PH 7.5)1.4 moL NaCl25 mmol/L CaCl2单去圬剂裂解液：50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)150 mmol/L NaCl1%TritonX-100100 g/mL PMSF5×SDS蛋白上样缓冲液：250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8)10%SDS50%甘油0.5%溴酚蓝500 mmol/L DTT(临用前现加)电泳缓冲液：25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 250 mmol/L甘氨酸(PH 8.3) 0.1%SDS转移缓冲液：5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 120 mmol/L甘氨酸0.1%SDS20%甲醇(V/V)储存于4℃备用PBS缓冲液137 mmol/L NaCl2.7 mmol/L KCl10.0 mmol/L Na2HPO42.0 mmol/L KH2PO4调节至PH=7.4洗涤缓冲液(PBS-Tween-20)：1000 mL PBS(PH7.4,0.01M) 500μL Tween-20封闭缓冲液：5 g脱脂奶粉100 mL PBST1.5细胞系同第一部分2方法2.1 A549/DDP细胞凋亡的检测2.1.1细胞凋亡形态学观察将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1×104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液继续培养24 h后终止培养，取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分钟。

②去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

③加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动数次。

④去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。

⑥上荧光显微镜观察，激发波长350nm，发射波长460nm。

2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色同上方法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL 试剂盒说明书操作。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定30分钟。

②PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液)，室温孵育30分钟。

③同上用PBS洗片，滴加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中)，在冰浴中孵育2分钟。

④PBS洗两次，滴加50μL的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育60分钟。

⑤PBS洗两次，滴加50μL的转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30分钟。

⑥PBS洗两次，加入DAB底物溶液，室温孵育10分钟。

⑦PBS洗两次，封片。

光镜下观察。

⑧结果判定：细胞核中有棕褐色颗粒者为阳性。

每张片至少观察500个细胞，计算每100个细胞内的阳性细胞，即凋亡指数(apoptotic index,AI)。

2.1.3流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡①取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液。

②接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。

③次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。

④常规消化，4℃离心(800rpm,5min)，收获各组细胞，转移至1.5mL离心管。

⑤弃上清，加入预冷的1×结合缓冲液100μL，重悬细胞，置于冰浴。

⑥加入5μL Annex in V-FITC和5μL PI于细胞悬液中，混匀，4℃避光染色10min。

⑦补加490μL结合缓冲液混悬细胞，立即行FCM分析。

2.2姜黄素对A549/DDP细胞caspase-8的影响取对数生长期A549/DDP细胞，常规消化，制备成105/mL细胞悬液，接种于直径60mm培养皿中，每孔4mL，细胞培养箱中过夜培养。

次日吸弃原细胞培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液，继续培养24h。

2.2.1样品制备①提取细胞总蛋白：a.培养液中悬浮细胞蛋白的提取：各浓度姜黄素处理细胞24h后，终止培养。

将培养皿中的培养液转移至15mL塑料离心管中，4℃，2500rpm离心10min，弃上清，4℃1×PBS洗涤两次，加入单去污剂裂解液100μL于冰上裂解30min，将上清转移至1.5mL塑料离心管，备用；b.贴于培养皿上细胞蛋白的提取：4℃1×PBS洗涤培养皿两遍，加入单去污剂裂解液300μL于冰上裂解30min。

裂解完毕后，用细胞刮片将细胞刮于一侧，转移至1.5mL塑料离心管中，4℃，12000rpm离心10min。

c.将离心后的上清液与从a中得到的裂解上清混合，4℃，12000rpm离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中，置于－20℃备用。

②BCA法蛋白定量。

③取总蛋白含量相等的上清体积，加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，沸水煮5min，12000rpm离心10min，备用。

2.2.2电泳采用微型垂直蛋白电泳系统进行SDS-变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，缓冲系统为Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

先后配制10%的分离胶及4%的浓缩胶，凝固后用微量加样器向加样槽中加入样品和次高分子量蛋白质标准，电泳装置与电源相连，凝胶上所加电压120V，当染料前沿进入分离胶后，把电压提至160V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源。

2.2.3转移将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移缓冲液中平衡15min，再在转移缓冲液中进行电转移；将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，恒压60V，冷却系统中转移2h。

转移完成后将膜在丽春红染液中染色，观察电转结果。

剪下目的蛋白部分，做好标记，放入双蒸水中漂染，褪去染液颜色。

2.2.4 Western blot①封闭：将膜置于平皿中，加入封闭液于室温缓慢摇动1h。

②与一抗孵育：将鼠抗人Caspase-8 p10单抗及β-actin作为一抗用PBS稀释(1:1000)，与膜共同封入塑料袋中，4℃过夜。

③洗膜：将膜从塑料袋中取出，PBST振摇漂洗3次，每次10min。

④与二抗孵育：将HRP标记羊抗鼠抗体作为二抗用PBST稀释(1:3000)，与膜共同封入塑料袋中，室温缓慢摇动1h。

⑤洗膜：同③。

⑥化学发光：将膜上液体用滤纸吸干，置于化学发光底物反应系统中反应5min，暗室X-光片1~5min。

显影20sec，定影10min.⑦扫描后，用LeicaQwin图象分析软件进行吸光度积分值分析。

2.3统计学处理用SPSS11.0统计软件包处理，统计学方法采用单因素方差分析，SNK-q检验，x2检验，P＜0.05认为有统计学意义。

3结果3.1 A549/DDP细胞凋亡的检测3.1.1细胞形态学改变荧光显微镜下观察，姜黄素组部分细胞的细胞核均有破裂，呈大、小不等，被荧光染料着色成致密浓缩发白发亮的细胞核，此为典型的细胞凋亡形态。

其中以40μmol/L姜黄素组最多，对照组只见很少凋亡形态细胞(附图1)。

3.1.2 TUNEL检测细胞凋亡指数原位DNA缺口末端标记染色，凋亡细胞核呈棕黄色，易于识别(附图2)。

0，5、l0、20、30、40μmol/L的姜黄素作用于A549/DDP细胞24 h 后，凋亡指数分别是(2.6±0.5)%、(10.7±2.3)%、(20.5±3.1)%、(28.6±3.4)%、(35.7±0.4)%、(49.5±4.4)%，显示出明显的剂量依赖关系(P＜0.05)。

3.1.3流式细胞仪检测细胞凋亡率不同浓度姜黄素作用于A549/DDP细胞24 h后，经Annexin-V和PI 进行染色后，用流式细胞仪分析凋亡细胞。

流式细胞仪分析，获得由四个象限组成的细胞直方图(图5)。

第1象限代表细胞收集过程中出现的损伤细胞(An-PI+)，第2象限代表晚期凋亡细胞和坏死细胞(An+PI+)，第3象限代表正常细胞(An-PI-)，第4象限代表早期凋亡细胞(An+PI-)。

本实验主要观察早期凋亡细胞，早期凋亡细胞即An+PI-细胞所占的百分比分别为2.93%、3.68%、7.71%、20.23%、23.0%、32.15%，显示出明显的剂量依赖关系(P＜0.05)。

3.2 Western blot的结果不同浓度姜黄素处理A549/DDP细胞24h后，出现Caspase8活性裂解片段P10的蛋白条带(附图3)，且条带光密度积分值随姜黄素浓度而增强(图6)。

4讨论细胞凋亡是细胞生物体的一种重要的自稳机制，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程。

研究表明，肿瘤的发生很可能就是由于细胞增殖和凋亡失衡，导致肿瘤细胞无限无序增殖所致。

诱导肿瘤细胞凋亡是许多抗癌成分十分重要的抗癌机制之一。

肿瘤化疗过程中，凋亡细胞很快被体内的巨噬细胞清除，对周围的炎症反应很少。

因此通过诱导凋亡而杀死肿瘤细胞具有更少的毒副反应，目前通过诱导或促进肿瘤细胞凋亡正成为肿瘤防治的新思路，也是评估抗癌药物作用能力的重要指标。

细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst染色细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。

本部分实验中，经过不同浓度姜黄素干预24 h后的各组细胞，用Hoechst33258荧光染料染色后，在荧光显微镜下观察，姜黄素干预组均能找到较多胞核致密浓缩发白发亮的细胞，并随着姜黄素浓度增加而增多，而对照组只见很少呈凋亡形态的细胞，这表明姜黄素可诱导A549/DDP细胞凋亡。