厌氧细菌和古菌样品采集

厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程

起草单位：中国科学院微生物研究所

目次

前言 (3)

厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程 (4)

1 范围....................................... (4)

2 术语和定义................................. .. (4)

3 样品采集................ (4)

4 样品分离..................... .. (5)

5 分离菌种的培养 (6)

参考文献 (7)

前言

对于厌氧细菌和古菌，在进行取样、分离和培养的各个环节均必须注重这类微生物的特性，采用相适应的方法，使采集的样品具有代表性，尽可能保持其在原生境的种类和数量，并通过分离和培养将其反映和显示出来，同时取得所需的试验菌种。

本规程规定了厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养的方法和要求。

厌氧细菌和古菌样品采集、分离、培养技术规程

1 范围

本规程规定了厌氧细菌和古菌样品采集的要求及根据样品量的大小所应采取的采样方法；规定了厌氧细菌、古菌样品分离和培养的具体方法。

本规程适用于不同生境中厌氧细菌和古菌样品的采集；以及各类厌氧细菌和古菌的分离培养。

2 术语和定义

本规范采用下列术语和定义。

2.1 厌氧细菌和古菌 Anaerobic Bacteria and Archaea

厌氧细菌和古菌如梭菌属（Clostridium）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等，是指要求在没有分子氧条件下才能生活的各种细菌和古菌。本文所指厌氧细菌和古菌为专性厌氧细菌和古菌，

2.2 Hungate厌氧技术 Hungate method

Hungate厌氧技术是美国微生物学家Hungate于1950年发明的一套有效的用于厌氧菌分离和培养的技术，它包括培养基预还原和在无氧环境中进行的菌株分离和培养操作技术。利用该技术，许多严格厌氧细菌和古菌的分离、培养获得了成功。

2.3 厌氧手套箱 Anaerobic chamber (glove box)

厌氧手套箱利用预置在箱内的钯催化剂，催化氢气与氧结合生成水，从而达到除去箱内氧气的目的。它包括操作室和交换室两部分。操作室用于厌氧分离、培养，交换室用于操作室内外物品的传递。

3 样品采集

采集厌氧细菌和古菌样品时，应尽可能避免将样品较长时间暴露于空气中,尽快将采集的样品带回实验室。根据放置样品所用容器的不同，可将样品的采集方法分为：厌氧试管法、厌氧罐或厌氧袋法、棉拭子法三种，采集时应视具体情况，选择其中一种方法。

3.1 厌氧试管法

3.1.1 仪器和用具

3.1.1.1厌氧试管

带丁基胶塞的可密封的试管、小瓶，或其他容器。可通入无氧气（O

2

）的氮

气（N

2）、二氧化碳气体（CO

2

）、或氮气、二氧化碳气体和氢气的混合气体（CO

2

、

N 2和H

2

），以置换管内空气，创造厌氧条件。

3.1.1.无菌注射器。

3.1.2 稀释液

常用磷酸盐缓冲液做为稀释液（NaCl 0.85g，Na

2HPO

4

0.25g， NaH

2

PO

4

0.56g，

蒸馏水 100ml）。

3.1.3 取样

对于土壤、污泥等可大量获得的样品，可将样品直接装入灭菌的厌氧试管中，直至装满，塞上胶塞，拧紧螺口胶盖。对于从动物肠道、口腔等部位采集的少量样品，直接将样品迅速装入灭菌的、盛有预还原稀释液的厌氧试管内，立即塞上胶塞，拧紧螺口胶盖。对于液体样品应用无菌注射器抽取样品，取样后立即排除多余空气，将样品注射进灭菌的厌氧试管中。

3.2 厌氧罐或厌氧袋法

3.2.1 仪器和用具

3.2.1.1厌氧罐或厌氧袋

可以密封的容器。利用化学方法，去除容器中的氧气，创造厌氧环境。

3.2.1.2灭菌的平皿、三角瓶或试管

3.2.2 取样

将样品尽快装入灭菌的平皿、三角瓶或试管等器皿中，然后放入厌氧罐或厌氧袋内。

3.2.3 棉拭子法

采取临床样品时常用此法。

3.3.1 仪器和用具

3.3.1.1厌氧试管

同4.1.1.1。

3.3.1.2棉拭子

无菌棉拭子，装在厌氧试管中。

3.3.1.3半固体琼脂培养基

去除氧气的半固体培养基，分装在厌氧试管中。

3.3.2 取样

用棉拭子采样后，直接插入装有半固体培养基的厌氧试管内。

4 样品分离

厌氧细菌和古菌样品的分离，通常采用系列稀释滚管法或平皿涂布法。对于样品中含量很少的微生物如光合细菌，应先用富集培养基对其进行富集培养，然后利用选择性培养基进行分离。

4.1 滚管法

4.1.1 仪器和用具

4.1.1.1 厌氧试管

同3.1.1.1。

4.1.1.2振荡器

4.1.1.3无菌注射器、弯头毛细管、乳胶管

4.1.1.4盛有冰块的托盘或滚管机

4.1.1.5显微镜

4.1.2 稀释液

同4.1.2。

4.1.3 滚管分离

4.1.3.1样品稀释

取1g或1mL（混合均匀的液体）样品，置于装有9mL或4.5mL预还原稀释液的厌氧管内,在振荡器上振荡均匀，用无菌注射器取1mL或0.5mL样品稀释液加至另一装9mL或4.5mL的稀释液的试管内。按此操作依次制备成10-1—10-9的样品稀释液，备用。

4.1.3.2滚管

将盛有无氧无菌琼脂培养基的试管加热至100℃，使琼脂熔化，并保温在50℃左右的水浴中，备用。用无菌注射器取至少3个稀释度的样品稀释液0.1-0.2mL，加入盛有溶化的预还原培养基的厌氧试管内，将试管平放于盛有冰块的盘中或放在特制的滚管机上迅速滚动，培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。适温培养后，在琼脂层内或表面形成菌落。滚管前最好用显微镜观察待分离的样品，了解样品中的细菌或古菌形态类型及其浓度，作为分离样品的参考。

4.1.3.3分离培养

挑取单菌落时，将形成单菌落的试管和一支盛有无菌、厌氧培养液的试管固定在适当的支架上，去掉试管的胶塞，插入灭菌的注射器针头，通入气流速度适当的、无菌的、高纯氮气。将无菌弯头毛细管小心插入形成单菌落的试管内，轻轻吸取预先作好标记的单菌落，转移至盛有厌氧培养液的试管内，塞上胶塞，拧紧螺口胶木盖，适温培养。