手性药物的液相色谱法分析法在药物分析中的应用1

手性药物的液相色谱法分析法在药物分析中的应用第2组：冯文立0903511107彭新平0903511109李茂山0903511105
摘要
手性药物在目前使用的药物中占有很重要的地位，而液相色谱法在手性药物拆分中有广泛的应用。

本文就手性药物的分离测定中的液相色谱分析现状、分类、具体应用案例研究进行整理和描述，以此来帮助研究手性药物的药动学过程、药理和毒理作用机制、以及手性药物质量控制。

进而指导临床的应用。

手性药物在临床应用的化学药物中占有相当比例，但绝大多数仍以外消旋体给药，药理学研究表明，手性药物的各对映体在进入人体后药理作用有着明显差异，而市场上手性纯的药物和单一光学异构体的药物急剧增加，因此，手性药物的分离，测定对研究手性药物的药动学代谢过程，药理和毒理作用机制以及手性药物的质量控制等多方面具有重要的意义，本文随手性药物研究中应用较多的液相色谱加以综述。

Abstract
Chiral drugs play an important role in current use of drug, Moreover, liquid chromatographic method on chiral resolution have been widely used. Therefore This paper by the separation of chiral drugs determination of liquid chromatographic analysis situation, classification, application case studies were finishing and description, so as to be of the chiral drugs help to pharmacokinetic process, pharmacological and toxicological effect mechanism, and chiral drugs quality control and guide clinical application in the final.Chiral drugs in clinical application of chemical drug occupies scale, but most still away to spin body other than medicine, pharmacology study show that the chiral drugs each enantiomers in entering the human body pharmacological effects have obvious difference, and the market to pure drugs and sex of a single optical isomers drugs increase sharply, therefore, the separation of chiral drugs, determination of chiral drugs pharmacokinetic metabolic process, pharmacological and toxicological effect mechanism, and the quality of the chiral drugs control and so on various has an important
关键词：手性药物液相色谱法药物分析
前言[1]
据报道：天然或半合成药物几乎都有手性，其中98%以上为光学活性物；全合成药物中40%为手性药物；目前常用的700多种药物有一半至少含有一个手性中心，其中90%使用外消旋体。

很多内源性大分子物质，如酶、载体、受体、血浆蛋白等都具有手性特征。

手性对映体药物在吸收、分布、代谢与排泄过程中，通过与体内大分子的不同立体结合，产生不同的药理作用和不良反应。

所以，针对这些情况，下面就做一简单的综述。

一、手性药物色谱法的总体情况概述
1.手性药物[5]
许多药物中存在着分子组成与构造完全相同但分子的立体结构不同的化合物，他们是立体异构体，不能完全叠合但能互为镜像，，如左手跟右手，这就是手性药物。

2.研究背景
1992年FDA发布手性药物的指导原则，要求所有在美国上市的消旋体新药，生产者需提供详细报告，说明药物中所含对应体各自的药理作用，药性和效果，显然单一异构体的实验次数比较单纯，经济上更加合算。

目前普遍使用2000多种合成药物中有600余种为手性药物，而活性的单一对应体不足一百种，其他500种都是左右旋混在一起的消旋体药物。

1999年，手性药物市场第一次超过1000亿美元，单一异构体药物销售额达到1150亿美元，占世界药品市场的32%。

[2]
3.常用的手性药物测定技术
高效液相色谱法，气相色谱法，毛细管电泳，超临界流体色谱法。

高效液相色谱法(HPLC)在80年代初HPLC法迅速成为药物对映体分离和测定最为广泛应用的方法。

特别适用于极性强、热稳定性差的手性药物分析。

HPLC用于手性分离概括起来有两大类：间接（CDR)和直接方法(CSP)。

其中间接法（CDR) 又称为非对映体拆分法或柱前手性衍生化法。

对映体混合在处理中进行柱前衍生成一对非对映体，依其理化性质差异，在非手性柱上得以分离。

[3]
优点：1)可采用通用的非手性柱分离；2)通过衍生化可提高检测的灵敏度；3)分离条件简单；分离效果好。

缺点：1)要有可悲衍生化的基因;2)要有高光学纯度的手性试剂；3)衍生化和色谱过程中不能发生消旋作用；直接方法(CSP)：对映体之一与手性固定相或手性流动相添加剂间发生分子间的三点作用，另一对映体发生两点作用：行程短暂的非对映体的结合物，通过洗脱分离。

优点：1）能广泛适用于各类化合物；2）除非必须衍生化，否则无需高光学纯试剂；3）样品处理步骤简单；分离方便，定量分析可靠性较高。

缺点是：1)样品有时也许有柱前衍生；
2)对样晶结构有一定的限制；3)迄今为止cps商品已有40多种，但大多价格昂贵。

二、手性药物液相色谱的具体描述
1.HPLC法[4]
HPLC法在手性药物拆分中的应用远较GC广泛。

目前常用的方法有CDR法手性流动相添加剂（CMPA）法及CSP法。

2.CDR法：[5]
（1）手性衍生化反应条件
手性化合物对映体的化学结构中应具有易于衍生化的基团，如氨基、羧基、羟基或巯基等；手性试剂和反应产物须有稳定的化学和手性性质，手性试剂还须具有高的化学和光学纯度，且在贮存中不发生改变；手性试剂和反应产物在衍生化反应和色谱条件下应是稳定的，不会发生消旋化反应；衍生化反应生成的非对映体在色谱分离时应能显示高柱效。

（2）分离机制
非对映体在色谱系统中的差速迁移与下列因素有关；非对映体分子的手性结构、手性中心所连接的基团和色谱系统的分离效率（包括溶质分子与固定相和流动相之间的作用力，如氢键、偶极-偶极、电荷转移和疏水性等）。

反应产物的构型差异越大，分离越容易。

（3）检测
对映体的检测方法随着手性反应所生成的衍生物的不同而不同，常用的有UV 法、荧光法和电化学法等，随着HPLC-MS联用技术的发展，也可采用MS检测。

手性试剂的种类
目前常用的有酰化试剂、胺类试剂、异硫氰酸酯类、氯甲酸酯类、邻苯二醛和手性硫醇等。

3.CMPA法[6]
（1）手性包含复合法
经常采用的添加剂是环糊精（CD）和手性冠醚。

环糊精对疏水性和亲水性药物对映体都具有很强的包合作用。

此法已用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类、氯胺酮、苯妥英代谢物、美芬妥英及其代谢物、哌嗪类镇痛药、伪麻黄碱、去甲羟基安定等。

采用的固定相常为ODS、CN、C8、苯基、硅胶等。

检测方法多用UV和电导检测法（ECD）。

（2）手性配合交换法
将手性金属配合剂加入HPLC流动相中，形成三元非对映体配合物，此配合物与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应，由于其结构稳定性和能量的差异，使对映体得以分离。

配合交换系统使用水性流动相和疏水性固定相，洗脱顺序与反相HPLC一致，可采用反相柱，UV检测。

溶质疏水性增加，保留时间延长。

常用的手性配合试剂多为氨基酸及其衍生物，配位金属有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Cd2+等。

该法可用于分离氧氟沙星、氨基酸及衍生物、苯妥英类代谢物、多巴胺等。

（3）手性离子对色谱法
其原理是在HPLC流动相中加入反离子，使之与流动相中对映体生成非对映的离子对复合物，由于这些离子对复合物具有不同的稳定性和分配性质，在与固定相发生静电、疏水或氢键作用后，产生差速迁移而得以分离。

此法可用于拆分氨基酸类、β-受体阻断剂、羧酸及磺酸类等化合物。

4.CSP法[7]
将手性试剂化学键合到固定相上与药物对映体形成非对映体对复合物这种固定相称作CSP。

在CSP表面所形成的非对映体对可根据其稳定常数不同而获得分离，分离的效率和洗脱顺序取决于复合物的相对强度。

CSP的主要类型有蛋白质键合相、手性聚合物键合相、环糊精键合相和Pirkle型手性固定相等。

对于体内手性药物的分析，单独采用CSP法往往不能排除内源性杂质的干扰，采用非手性柱-手性柱联用技术能克服此不足。

此法将非手性柱与手性柱以柱切换系统或直接相连系统连接起来，经预处理的样品进样后，首先随流动相载入非手性柱上，被测手性药物与干扰成分分离，接着被测手性药物进入手性柱，不受干扰地各自拆分。

此法不仅能提高CSP的分离能力，而且能延长CSP柱的使用寿命。

三、具体应用
近年来，对手性药物的拆分定量分析进行了广泛深入的研究。

其中，对生物体液中药物对映体的分离分析，有利于了解各种对映体的药代动力学、体内代谢过程和生物利用度。

因此对手性药物对映体的拆分也是HPLC分析的热点。

手性HPLC拆分法是以现代HPLC技术为基础引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异而进行分离。

HPLC法拆分手性药物对映体可分为直接法和间接法。

前者是将不对称中心引入分子间，可分为手性流动相添加剂(CMP)法和手性固定相(CSP)法；后者又称为手性试剂衍生化(CDR)法，它是将不对称中心引入分子内。

手性试剂衍生化法是将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法进行分离和测定。

适用于不宜直接拆分测定的化合物如手性脂肪胺类、醇类等。

该法分离效果好，分离条件简便，但对手性衍生试剂的要求较高，操作比较麻烦，多在其它方法无法实现时才采用。

对生物样品中对映体拆分过程中，由于内源性物质及代谢产物的干扰，单用HPLC分析，易造成谱峰重叠，不能直接分析体内手性药物。

目前，使用多柱偶联技术已成功解决了该类问题。

目前，HPLC是在手性药物拆分中应用最多的方法之一，可以预见，该方法因其具有快速、方便、精确的特点，在未来的手性药物研究中，将得到更广泛的应用。

在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的
色谱图中,供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢
噻酚钠等头孢类药物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC 法进行鉴别. [8]
1.在杂质检查中的应用 [9]
HPLC分离效能高,灵敏,在药物的杂质检查中应用广泛.主要用于药物中有关物质的检查.“有关物质”是指药物中存在的合成原料,中间体,副产物,降解产物等物质,这些物质的结构和性质与药物相似,含量很低,只有采用色谱的方法才能将其分
离并检测.若杂质是已知的,又有杂质的对照品,可用杂质对照品做对照进行检查.若杂质是未知的,可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查.
2.在含量测定中的应用
用高效液相色谱法侧定含量可以消除药物中的杂质,制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰.中药材及其制剂组成复杂,基中不少有效成分的含量测定也越
来越多地采用了高效液相色谱法.
3.在体内药物分析中的应用[10]
HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12 g／mL以上)，填充柱种类多，且可供选择的检测器也多。

所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。

在国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测
器是紫外检测器。

多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获得良好分离效果。

结束语
通过系统分析手性药物液相色谱的应用，和近些年医药应用技术的发展，对手性药物的需求将会加大，针对其使用的质量，要求也应当越来越高。

需要更进一步地去研究手性药物的作用方式和在临床上应用的效果结合，并且借用科学地分析方法。

更好地发展药物，推动手性药理学、手性药物合成和研究生产开发。

参考文献
[1] 液相色谱法分离手性药物，百度文库，医药专业文献，
/view/b25879f8aef8941ea76e055a.html,2011.12．
[2] 彭清涛，胡文祥，谭生键．药物对映体HPLC分离测定研究新进展[J]．药学学报，1988，33（10）：793-800.
[3] 曾苏．高效液相色谱手性试剂衍生化法及其应用[J]．色谱，1994，12（6）：406-410．
[4] 罗维早，李章万，张志荣．手性药物的色谱分离进展[J]．华西药学杂志，2000，15（4）：295-298．
[5] Mathys K，Brenneisen R．Determination of (S)-(－)-cathinone and its metabolites (R，S)-(－)-norpseudoephedrine in urine by high-performance liquid chromatography with photodiode -array detection [J]．J Chriomator，1992，593：79-85．
[6] 曾苏．高效液相色谱手性流动相添加剂法分离药对映体[J]．色谱，1995，13(1)：21-26．
[7] 李新，曾苏．手性配位体交换流动相添加剂拆分对映体[J]．色谱，1996，14(5)：354-359．
[8] 吕湘林，杨实桂．光学异构体的手性HPLC拆分及其药学应用研究的进展[J]．药学学报，1998，23(1)：67-79．
[9] Gorag S，Herenyi B．α-Acid glycoprotein column in the high-performance liquid chromatographic analysis of some groups of chiral drugs[J]．J Pharm Biomed Anal，1990，8：841-848．
[10] 高效液相色谱在药物分析中的应用，仪表展览网，色谱专栏，
/bbs/showtopic-6708.html，2011，12．。