产谷胱甘肽酵母菌株培养基优化

和医药等领域的应用受到重视。国外对 GSH 的生物 产量[ 每 1 g 菌体产 GS H 的量（m g 数）] 。
合成进行了较多的研究，有不少研究集中于优化和 2. 4. 2 氮源 分别考察不同浓度有机氮源（蛋白胨
控制流加培养合成 GSH，基因工程和固定化技术已 和酵母粉）和无机氮源（硫酸铵、尿素和氯化铵）
1.2 g/L K HPO and1.8 g/L KH PO . Conclusion The optimal medium composition can be determined.
2
4
24
Key words：glutathione; yeast; medium optimization
谷胱甘肽（g1 ut a t h i on e，GS H）是具有重要 2. 4. 1 碳源 除个别酵母能利用糊精和淀粉外，一
应用于 GSH 的生产。近年国内也开展了一些研究。 对 GSH 产量和含量的影响。进一步考察酵母粉浓度
本文研究优化发酵法生产 GSH的酵母菌培养基。 对 GSH 积累的影响。
1 材料 1.1 菌种
2.4.3 磷酸盐 先将 K HPO 和 KH PO 作为一个整
2
4
24
体来考虑。按相等的质量分数加入培养基来考察不
液、1 mL 3 % 甲醛液，摇匀反应 2 min，加入 5 mL
DTNB 分析液，摇匀后 25 ℃水浴静置 30 min，测定
各管 A
，记录结果[2,3]。
412 nm
2.4 培养基优化
单因素实验按2.1培养条件筛选出对GSH产量影响
显著的碳源、氮源等，考察其浓度对 GSH 产量的影响。
然后以正交试验确定最佳碳、氮源和无机盐浓度。
参考文献
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[2] 马同森，刘绣华，赵东保，等. 紫荆花红色素的提取及 其稳定性研究[ J ] . 化学研究，1997，8（4）：36-40.
[3] 黎彧，高虹，欧步青. 应用微波技术提取紫荆花色素的研 究[ J ] . 林产化学与工业，2004，24（2）：80-82.
正交试 验确 定最佳 碳源 、氮源和 无机 盐浓度 。结果 最佳培养基的基本组成：2 . 5 % 葡萄 糖，1 % 酵母粉 ，0 . 3 %
硫酸铵，0.03 % 硫酸镁，1.2 g/L 磷酸氢二钾和 1.8 g/L 磷酸二氢钾。结论 确定了最优培养基组成。
关键词：谷胱甘肽；酵母菌；培养基优化
中 图 分 类 号 ：Q 5 1 6
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产谷胱甘肽酵母菌株培养基优化
陈俭梅 1，袁建国 2 ，刘代成 1
（1. 山东师范大学，山东 济南 250014；2. 山东省食品发酵工业研究设计院，山东 济南 250013）
摘 要：目的 筛选对谷胱甘肽产量影响显著的碳源和氮源，考察其浓度对产量的影响。方法 通过单因素实验和
图5 磷酸盐总浓度对GSH积累的影响
图6 磷酸盐不同配比对GSH积累的影响
图3 GSH总量随酵母粉浓度变化曲线 如图 3 所示，添加酵母粉利于 GSH 的积累。当
3.4 无机盐的影响 由图 7 可以看出，MgSO 对 GSH的积累最有利。
4
酵母粉浓度超过 1 % 时，GSH的积累量变化不明显。
3. 2. 2 无机氮源 考察硫酸铵、尿素和氯化铵，结
大；加入 Fe2+、Cu2+ 后溶液红色加深，表明 Fe2+、 Cu2+ 对 RPFC 有一定的增色效果，加入其它 4 种金属 离子后未见颜色变化，吸光度变化较小，表明它们
坏血酸等添加剂对其稳定性影响较小，H 2O 2， Na SO 对RPFC具有一定的破坏作用，苯甲酸钠超过
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0.5 % 时色素保存率明显下降。金属离子 Na +，
4
酸盐的浓度。
3 结果 3.1 碳源对积累 GSH 的影响
见图 1 、图 2 。
量除以发酵液体积即为菌体 的生物量（g / L ）[1]。
2.3 GSH含量分析
DTNB 法。取 6 mL 发酵液加入 4 mL 无水乙醇
摇匀，30 ℃水浴 2 h 后离心，上清液备用。在比
色管中先后加入 3 mL Tris-HCl 缓冲液、2 mL 上清
对 RPFC 稳定性影响较小。
Mg2+，Zn 2+，Al3+ 对 RPFC 稳定性无影响，Cu2+，
表 2 金属离子（g/mL）对 RPFC 稳定性的影响
Fe2+ 对 RPFC 影响较小，Fe3+ 可使 RPFC 变为褐色， 因此应避免与 Fe3+ 接触或共存。
4 结论 0.1 %RPFC盐酸溶液在可见光区526 nm处有最
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表2 培养基条件优化正交试验
A3
B
3
C
2
D
3
E
；
2
即
：2
.
5
%
葡萄糖、1
%
酵母粉、
0.3 % 硫酸铵、0.03 % MgSO4、1.2 g/L K2HPO4
medium composition was as follows: 2.5 % dextrose, 1 % yeast powder, 0.3 % (NH ) SO , 0.03 % MgSO ,
42 4
4
收稿日期：2009-03-13 作者简介：陈俭梅（198 3-），女，山东威海人，硕士，研究方向食品生物技术 E-mail: cjm 566@163 .com
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当，硫酸铵稍好。选取硫酸铵为无机氮源。
Leabharlann Baidu
3.3 磷酸盐的影响
磷是酵母生长和发酵所必需。由图 5 可见，磷酸
盐总浓度在 3g/L 时对 GSH 的积累最有利。由图 6 可
见，K HPO ∶KH PO 为 2∶3 时对 GSH 积累最有利。
2
4
24
图2 葡萄糖初始浓度对GSH总量的变化曲线 由图 2 可知，葡萄糖初始浓度逐渐升高时，GSH 含量先升高后降低；GSH 产量在初糖浓度 2 % 时达 到最高。初糖浓度的升高不但增强了对酵母生长的 底物抑制作用，而且其快速代谢产生大量乙醇，抑 制 GSH 的合成。初糖浓度从 30 g/L 升高到 50 g/L 时 GSH 产量下降了 40.8 %。 3.2 氮源对积累 GSH 的影响 3 . 2 . 1 有机氮源 考察蛋白胨和酵母粉。结果表 明，酵母粉为最合适的有机氮源。可能因为酵母粉 中含多种生长因子和氨基酸，能促进细胞生长和 GSH 的合成。进一步考察酵母粉浓度对 GSH 积累的 影响，结果如图 3 。
（Sigma）；0.5 M Tris-HCl 缓冲液；φ =0.03 甲醛 溶液；还原型谷胱甘肽（A m r es co）；其余试剂均
表1 2种磷酸盐不同配比实验设计
购自天津市广成化学化学试剂公司。
2 方法
2.1 培养方法
YEPD 培养基：酵母粉 10 g，蛋白胨 20 g，葡 萄糖 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 6.0，115 ℃湿热 灭菌 20 min。从新鲜斜面接一环酵母菌于 30 mL YEPD 培养基中，30 ℃、200 r/min 摇床培养 20 h。 按 10 % 接种量接种于 50 mL 培养基中， 30 ℃、200 r/min 摇床培养 30 h。 2.2 生物量测定
（1. Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 2. Shandong Food and Fermentation Industry Re-
search and Design Institute, Jinan 250013, China）
Abstract：Objective To conduct the screening of carbon source and nitrogen source and investigate their
果见图 4。
图4 不同无机氮源对GSH积累的影响 由图 4 可见，硫酸铵和尿素效果最佳且大致相
图7 不同无机盐对积累GSH的影响 3.5 正交试验
分 析 正 交 试 验 结 果 ， 葡 萄 糖 （ A ）> 硫 酸 铵 （ C ）> 酵 母 粉 （ B ）， 培 养 基 理 论 最 佳 组 合 为 ：
图1 不同碳源对积累GSH的影响 由图 1 可见，对细胞干重而言，蔗糖的效果最好； 对 GSH 总量而言，葡萄糖和蔗糖效果相当。综合考虑 来源和价格，选择工业葡萄糖作为碳源进行后续实验。
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生理功能的三肽，一些酶的辅酶，可保护蛋白质的 般酵母菌都利用单糖和二糖作碳源[1]。本实验考察不
巯基，维持某些酶的活性。GSH 具有抗脂质氧化、 同浓度葡萄糖、蔗糖、麦芽糖对 GSH 的影响。发
解毒、防止白内障发生和保护皮肤等作用，在食品 酵 33 h 后，测定并比较 GSH 含量、生物量及 GSH
[4] 李进，瞿伟菁，张素军，等. 黑果枸杞色素的抗氧化活性 研究[ J] . 中国中药杂志，2006，31（14）：1179-1184.
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产朊假丝酵母菌（C a n d i d a u t i l i s ）。
同浓度的磷酸盐对积累GSH的影响。2种磷酸盐的不
1.2 化学试剂
同配比可调节培养基 pH 值。按表 1 设计研究不同配
5 , 5 ’- 二 硫 代 双 ( 2 - 硝 基 ) 苯 甲 酸 ( DTNB) 比对 GSH 积累的影响。
文献标识码：A
文章编号：1 6 7 2 -9 7 9 X (2 00 9 )0 5 -0 0 3 3 -0 4
Medium Optimization of Glutathione-producing Strain
CHEN Jian-mei 1*, YUAN Jian-guo 2, LIU Dai-cheng 1
3.7 常见无机盐对稳定性的影响
大吸收峰。RPFC 易溶于水、醇、丙酮等极性溶剂，
供试的7种金属离子对RPFC溶液的影响结果见 不溶于石油醚等非极性溶剂。RPFC水溶液颜色随pH
表 2。加入 Fe3+ 后溶液迅速变为茶褐色，吸光度有 值变化而变化，酸性条件下呈红色，pH 1～2 时颜
较大幅度的升高，表明 Fe3+对 RPFC稳定性的影响较 色最鲜红。RPFC 耐光性、耐热性较好，蔗糖、抗
和1. 8 g/L KH PO 。在最佳培养基条件下GSH总量 24
为 96 mg/L。
参考文献
[1] 刘娟，何秀萍，王雅琴. 高产谷胱甘肽的酵母融合菌株的
选育及其培养条件的研究[J]. 微生物学报，2003，43（1）： 99-103. [2] 刘娟，王雅琴，刘刚. 发酵液中还原型谷胱甘肽三种测定 方法的改进及其比较[ J ] . 北京化工大学学报，2004，31 （3）：35-38. [3] 张少辉，高书文. 谷胱甘肽片的紫外分光光度测定[J]. 辽 宁 大 学 学 报 （ 自 然 科 学 版 ）， 1992，19（4）：66-69.
取一定体积发酵液，3 000 r/min 离心 5 min，去 离子水洗 2 次，收集菌体 60 ℃烘干至恒重。所得质
2. 4. 4 无机盐研究 0.3 g/L 的 MgSO4 、CaCl 2 和 FeSO4 对 GSH 积累的影响。 2. 4. 5 正交试验 根据单因素实验结果，通过正交 试验确定葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、MgSO 和磷
influences on the yield of glutathione. Methods The single factor and orthogonal experiments were adopted to
obtain the optimal concentrations of carbon source, nitrogen source and inorganic salts. Results The optimal