[理学]防止染菌

4、灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温期间— —产生过多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。 如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于 炎热的夏季预热至800C的培养基采样培养， 可发现无法计数的大量的芽孢杆菌；而在 冬季取样的培养中，则仅发现2～3个芽孢 杆菌。故染菌率因季节不同而发生明显变 化。
染菌的防治
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其 它菌生长繁殖。
一、染菌的影响 发酵过程污染杂菌，会严重的影响 生产，是发酵工业的致命伤。 造成大量原材料的浪费，在经济上造 成巨大损失
扰乱生产秩序，破坏生产计划。
遇到连续染菌，特别在找不到染菌原 因往往会影响人们的情绪和生产积极性。 影响产品外观及内在质量
不 同 产 品
不 同 产 品
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素 等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所 得，但也会造成不同程度的危害。如 杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常 代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗 生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制 和杀灭作用。
不 同 产 品
疫苗生产染菌危害很大。现在疫苗多 采用深层培养，这是一类不加提纯而 直接使用的产品，在其深层培养过程 中，一旦污染杂菌，不论死菌、活菌 或内外毒素，都应全部废弃。因此， 发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失 也越大。
Байду номын сангаас本工业技术院发酵研究所抗生素发酵染菌原因分析
项目 种子带菌或怀疑种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 总空气系统有菌 泡沫冒顶 夹套穿孔 盘管穿孔 接种管穿孔 阀门渗漏 搅拌轴密封渗漏 罐盖漏 其它设备渗漏 操作原因 原因不明 百分率% 9.64 0.19 0.79 19.96 0.48 12.36 5.89 0.39 1.45 2.09 1.54 10.13 10.15 24.94
沉降菌 （ settling microbe ）：采用平板暴露法收 集空气中的活微生物粒子，通过专用的培养基，在 适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
空气浮游菌采样器
采样点数
采样面积 （ m 2 ） < 10 ≥ 10 ― <20 ≥ 20 ― <40 ≥ 40 ― <100 ≥ 100 ― <200 ≥ 200 ― <400 ≥ 400 ― <1000 ≥ 1000 ― <2000 2000 洁 净 度 级 别 100 2 ― 3 4 8 16 40 80 160 400 800 1 万 2 2 2 4 10 20 40 100 200 10 万 2 2 2 2 3 6 13 32 63
采样点位置： ① 采样点一般在离地面 0.8米高度的位置上均 匀布置。 ② 采样点多于5点时，也可以在离地面 0.8 -1.5 米高度的区域内分层布置，但每层不少于 5 点
遇到无菌室严重带菌则要用甲醛熏蒸。做
法是：用甲醛和高锰酸钾混合熏蒸：一般每平方 米需40％甲醛10毫升、高锰酸钾8克，进行熏蒸。 使用时，先密闭门窗，量甲醛溶液盛入容器中、 然后倒入量好的高锰酸钾，人员随之离开接种室，
无菌室要求
用消毒药水如新洁而灭擦桌子、拖地，开启超净 台的通风。
在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时， 关灯后15分钟再接种。 接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台鼓 风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过滤器， 保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气不可能进入 接种区域，保证无菌条件。 接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒精 棉球擦干净。
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞 争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很 少，抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料 量，用酸碱调 pH 值，缩短培养周期等措施予 以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不 多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种 再用。
（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物，特 别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。 因此如果染菌不多，对生产影响不大。如果染 菌严重，又破坏性较大，可以提前放罐。
（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响 1、发酵染菌对过滤的影响 染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶， 所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导 致过滤困难。即使采取加热、冷却、添加助滤 剂等措施，使部分蛋白质凝聚，但效果并不理 想。
二、染菌的原因
（一）发酵染菌率计算基准 总染菌率指一年发酵染菌的批（次）数与 总投料批（次）数之比的百分率。染菌批次数 应包括染菌后培养基经重新灭菌，又再次染菌 的批次数在内。 总染菌率%=
（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，对绝大部分罐批 染菌的原因是比较清楚的，但在实际生产中 发酵染菌率仍比较高，可以说产生这种现象 大多数是由于工作中“明知故犯”“不负责 任”和“侥幸心理”所造成的。例如，灭菌 的蒸汽压不足不能灭菌；设备有渗漏不能进 罐等等都是众所周知的，但因为有侥幸心理 还是照样灭菌，进罐，结果以污染杂菌而告 终。现将我们收集到的国内外几家抗生素工 厂发酵染菌原因列于下：
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异， 如污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难 过滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发 酵液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产 平衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降 低过滤收率，直接影响提炼总收率。
2、发酵染菌对提炼的影响
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的 水溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易 发生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响 进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如 链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在 离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附， 大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有 的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一 起进入洗脱液，影响进一步提纯。
（3）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂 菌大量产酸，培养液 pH 下降；糖、氮消耗快， 发酵液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止， 有时甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发 酵液发臭，产生大量泡沫。 措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变 化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放 罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输 送一部分到染菌罐，抑制杂菌。
补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀门渗 漏，一般不会是种子问题
五、染菌的防止
1、防止种子带菌
制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以控制。
沙土制备时要多次间歇灭菌
注意接种时的无菌操作 子瓶、母瓶的移种和培养 无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要 供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以 灭菌，或用化学药品灭菌。
2、种子及发酵液无菌状况检测 酚红肉汤培养基检测 平板划线
显微镜观察
四、染菌情况分析
染菌的原因有多种，对于实际情况如何分析呢？
1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问题。 如种子带菌、培养基灭菌不彻底、罐有渗漏、 死角、分过滤器失效
2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题，特别是 总过滤器长期没有检查，可能受潮失效；移种 或补料的分配站有渗漏或灭菌不彻底 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底 4、中后期染菌
静态测试 （ at-rest test ）：洁净室（区）净化空 气调节系统已处于正常运行状态，工艺设备已安 装，洁净室（区）内没有工作人员的情况下进行 的测试。
动态测试 （ operational test ）：洁净室（区）已 处于正常工作状态下进行的测试。
浮游菌 （ airborne microbe ）：采用空气采样器 （如撞击式或离心式采样器）收集悬浮在空气中的 活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长 条件下繁殖到可见的菌落数。
第四制药厂链霉素发酵染菌原因分析 项目 外界带入杂菌（取样、补料） 设备穿孔 空气系统有菌 停电罐压跌零 接种 蒸汽压力不足或蒸汽量不足 管理问题 操作违反规程 种子带菌 原因不明 百分率% 8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.80 1.60 0.60 35.00
造成染菌的主要原因总结 1、设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿 孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它设备漏 等。从日本工业技术院发酵研究所对染菌原因分析 发现，这类染菌占 33.85 ％，上海三厂的分析这类 染菌为37.5％。所以说加强设备本身及附属零部件 的严密度检查，对制服染菌是极其主要的，也是重 要的。
3、不同时间染菌对发酵的影响
污染时间是指用无菌检测方法确准的 污染时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后，需有足够的生 长、繁殖的时间才能显现出来，显现的时 间又与污染菌量有关。污染的菌量多，显 现染菌所需的时间就短，污染菌量少，显 现染菌的时间就长。
（1）种子培养期染菌 由于接种量较小，生产菌生长初期 不占优势，而且培养液中几乎没有抗生 素（产物）或只有很少抗生素（产物）。 因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液 糖等有机原料——杂菌的数量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量— —有无灭菌的死角 对减少或避免染菌仍然是十分必要的。
5、技术管理不善
技术管理就是要对发酵每个环节严格 控制，发酵中稍有不慎就可能染菌，所以 不能有侥幸心理而放松管理
三、无菌状况的检测 1、无菌室无菌状况检测
2、污染不同种类和性质的微生物的影响 （1）污染噬菌体
噬菌体的感染力很强，传播蔓延迅 速，也较防治，故危害极大。污染 噬菌体后，可使发酵产量大幅度下 降，严重的造成断种，被迫停产。
（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量 泡沫，即使添加消泡剂也无法控制逃液， 影响发酵过程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸， 致使pH下降，使不耐酸的产品破坏。特 别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热，不易 杀死，往往一次染菌后会反复染菌。