植物细胞悬浮培养

细胞悬浮培养的建立
愈伤组织的诱导
悬浮系的建立与继代培养 悬浮细胞的生长动态
悬浮细胞同步化
愈伤组织的诱导
• 选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶。 • 选择适宜的培养基：较高激素浓度；必要的 附加物质。
• 要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观 一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒 状，疏松易碎
悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 • 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态，因此，要达到完全同 步化是十分困难的。 • 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、 代谢以及生理生化状态等复杂化。 • 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化。 什么措施？
植物细胞培养
是在离体条件下， 将分离的植物细 胞通过继代培养 增殖，获得大量 细胞群体的一种 技术。
是人工种子、原 生质体培养、花 药培养等的支撑 技术。
植物细胞培养的特点:
• • • • • • ⑴大小; ⑵细胞团的形式存在; ⑶纤维素细胞壁和大液泡,易被剪切力损伤; ⑷生长缓慢 ⑸培养基成分丰富而复杂,易被微生物污染; ⑹需光、氧、二氧化碳
克隆愈 伤组织
细胞悬浮
过滤
与培养基 混合
植板
培养
看护培养（nurse culture）
• Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 • 优点：简便易行，效果好。 • 缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长 过程。
微室培养(microchamber culture)
• 在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细 胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖 形成细胞团的方法。由Jones等在1960年 设计的。 • 优点：可对培养细胞连续进行显微观察， 了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 • 缺点：培养基少，营养和水分难以保持， pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。 • 细胞起始密度：30～80个/室。
HO HO H
13 14 10 8 20
H HO H
17
HO H
13 20
H
17
H R
10
14 8
H HO H R
HO H
20S 原人参二醇 R=H 20S 原人参三醇 R=-OH
20R 原人参二醇 R=H 20R 原人参三醇 R=-OH
甾醇
R 17
HO 3
强心苷类（侧链为不饱和内酯环）
（3）生物碱：吡啶、喹啉、异喹啉等。 （4）醌类：包括蒽醌、萘醌等。 （5）蛋白质类：胰岛素、氨基酸、蛋白酶抑 制剂。植物病毒抑制剂、植物抗生素等。 （6）黄酮类：具有C6-C3-C6结构，生物合成 前体是苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。多为 治理心血管疾病和高血压的药物成分。
影响悬浮细胞生长的因素
• 起始愈伤组织的质量 • 接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般 在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的 细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有 效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接 种量。 • 培养条件：培养基、方式、温度、继代周 期。
影响悬浮细胞生长的因素
• 培养基
悬浮细胞的生长动态
悬浮细胞生长的衡量
• 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞 质量变化。 • 生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然 对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养 时间(t)的比值 p＝(lnx-lnx0)/t • 鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生 长情况 • 干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量
细胞平板培养（plating culture)
• 指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培 养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 – 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞 团不能超过6个细胞。 – 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养 基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升 – 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液 与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然 后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm 左右。
3．连续培养法(continuous culture)
• 问题: • 一直有细胞收获，浓度一般不高 • 细胞分裂快、易变异； • 由于是开放式操作，加上培养周期较 长，容易造成污染 • 对设备、仪器的控制技术要求较高。
悬浮培养（Suspension culture）
• 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个 游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培 养增殖的技术。 • 特点 1. 培养细胞可不断增殖，且生长速度快。 2. 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接 触和交换，细胞状态可以相对保持一致。
单细胞分离方法
• 机械法 • 具体做法： – 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 – 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过 摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 • 优点： – 细胞不受酶伤害； – 有利于进行细胞的生理和生化研究。
单细胞分离方法
• 酶解法
– 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采 用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保 护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高 游离细胞的产量。 • 酶解法的优点 – 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本 科植物叶片效果不好）。
O O N OH
+ -
O
蒽醌
OH
O
小檗碱
OCH3 OCH3
O
O
黄酮
植物细胞培养制药进展
• 第一个专利： 1956年Routin和Nickell首次数提出 利用植物细胞培养技术生产天然产物的第一个专利 • 工业植物生物技术 ：20世纪90年代明确提出 • 已经从 200余种药用植物获得了愈伤组织或细胞悬 浮培养物（傅经国等，2004） –国际 • 日本 ：紫草 人参 红豆杉 • 欧美 ：美国－红豆杉； 德国－紫锥菊 • 国内：罗士韦 叶和春 郑光植 侯嵩生 丁家宜
利用途径生产次生代谢产物的优点
• 不受季节、环境、病虫害影响. • 不占耕地，适用于贫瘠的地方 • 代谢产物生产可以在可控条件下进行,可以 通过细胞株筛选、特定生物转化途径与代 谢调控提高目标产物含量.
技术路线
• 目标植物选择 –→愈伤组织诱导→→液体培养→→培养条 件的优化→→反应器扩大培养 –→愈伤组织诱导→→固体、液体培养→→ 高产细胞系筛选→→生物合成途径的研究 –→器官分化（发状根）→→固体液体培养 条件的优化→→反应器扩大培养→→有效 成分提取、分离
• 培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌 式）；分批培养，半连续培养和连续培养 • 温度 25℃ • 继代周期
–指具有一定起始密度的细胞,从开始培养到 细胞数目和总重量增长停止的一个过程。 –培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟 期的长短、生长速率等决定。 –继代培养（Subculture）：继初代培养之 后的连续数代的扩繁殖培养过程。
双层滤纸植板培养
• Horsch 等 （ ） 建 立 1980
转移滤纸 培养基 培养细胞 培养皿 看护滤纸 饲养细胞层
固体培养
• 固体培养是在培养基中加入一定量的凝固 剂，经加热溶解后，分别装入培养用的容 器中，冷却后凝结成固体培养基。 • 优缺点
–简便易行、所占空间小 –生长的不平衡，易出现极化现象 –易堆积生长过程中排出的有害物质 –有些生理生化指标测定不方便
培养类型
• 按培养对象来说，可分为原生质体培养和单 细胞培养； • 按培养基类型可分为固体培养和液体培养； • 按培养方式可分为悬浮细胞培养和固定化细 胞培养 。
植物单细胞分离和初步培养
• 单细胞获得： • 机械法；酶解法；愈伤组织法 • 单细胞培养： – 平板培养(plating culture) – 看护培养法（nursing culture) – 饲养层培养(feeding layer culture)
–操作简单，培养周期短. –直接反映细胞生长代谢过程. –可直接放大 –不能控制底物浓度、细胞易老化、生长周 期短、效率低. • 两步成批培养法 –即使用两个生物反应器，第一个反应器用 于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次 级代谢产物的生产。
2. 半连续培养法 semi-continuous culture –重复分批式培养或换液培养.在细胞增长和产 物形成过程中,每间隔一段时间从中取出部分 培养液或细胞,剩余的细胞作为种子,再用新的 培养液补足到原体积,使生物反应器内的总体 积不变. –特点: –细胞可持续指数生长,并可保持产物和细胞在 一较高的浓度水平,培养过程中可延续很长时 间. –可进行多次收获. –操作简便,生产效率高.
3．连续培养法(continuous culture)
• 连续培养法是在细胞达最大密度之前，以一定速 度向生物反应器连续添加新鲜培养基，同时含有 细胞的培养液以相同的速度连续从生物反应器流 出，以保持培养体积恒定的培养方式。 • 该法的理论基础是根据Monod公式，即生长速度取 决于基质的浓度。 µ＝µmax·S/(Ks+S) µ =特定生长速度； µmax=特定最大生长速度；Ks= 饱和系数；S=基质浓度
悬浮系的建立与培养
callus
1g/10ml medium
150~250ml flask
100~120 rmp culture transfer 1 time/3d
centrifuge isolation
80 rpm
subculture
成功的悬浮细胞培养体系特征
• 悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般 在30～50个细胞以下。 • 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相 同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培 养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色。 • 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～ 3天便可增加一倍。
– 应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬 浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长 和分裂所需的特殊代谢物。 – 基本培养基成分的调节视不同的培养目 的而定 培养基设计时,一般均以诱导愈伤 组织形成的培养基为基础进行调整。常 用的培养基有MS、B5、LS 、N6等。 – 植物激素和其他附加成分的应用。
影响悬浮细胞生长的因素
• 常用的固化剂
–琼脂、明胶（10%）等
液体培养
1．成批培养法 batch culture
–细胞和培养基一次性加入到培养容器或生 物反应器内进行培养,在培养过程中培养液 体积不变,不添加营养成分,待细胞增长和产 物积累到适当的时间,一次性收获细胞、产 物和培养液的培养方法.
液体培养Baidu Nhomakorabea
1．成批培养法 batch culture • 特点：
植物细胞培养制药
•意义
药用植物是天然药物的宝库
植物细胞培养是生产药物的可能途径
•目前采用植物细胞培养生产的药物主要包括
（1）苷（甙）类：包括皂苷（人参皂苷、三七皂 苷、柴胡皂苷、著芋皂苷等）、强心苷（强心醇苷、 毛地黄毒配质衍生物等）、甘草甜苷、香豆精苷等。 （2）甾醇：包括菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、胆甾 醇、异岩藻甾醇等。
• 细 胞 周 期
饥饿法
• 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不 能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂 不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥 饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 – 氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞 – 磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化 细胞。 • 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时， 细胞分裂又可重新恢复。
细胞平板培养（plating culture)
• 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植 板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细 胞总和中所占的比例。
每个平板形成的细胞团数 植板率＝
每个平板接种的细胞总数
细胞平板培养（plating culture)
• 优点：
①单细胞在培养基中分布均匀，便于在显 微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株 筛选和突变体筛选的常用方法。 ②由于它具有筛选效率高、筛选量大、操 作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、 分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产 物合成等。 • 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造 成毒害或影响组织吸收。
• 两阶段连续培养法
–于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该 培养基，而于第二反应器中投入生产培养基。
3．连续培养法(continuous culture)
• 特点: • 细胞能在近似恒定状态下生长、营养 物质浓度、产物浓度、pH基本保持恒 定，细胞浓度以及细胞比生长速率可 基本维持不变，细胞维持持续指数增 长。 • 稳定状态可有效地延长分批培养中的 对数生长期。