表观遗传学研究实验技术简介
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将DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，结果与 标准品比较，测量254nm处的吸收峰值，计算内/ (5mC+5C)的积分面 积就得到基因组整体的甲基化水平。 这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样本检测，能够明确显示 目的片段中 CpG 位点甲基化的情况。但存在的问题是不能对甲基化的 CpG位点进行定位。
ChIP on chip
ChIP on chip将ChIP操作与基因芯片技术分析法(chip)相结 合，是研究目的蛋白质与基因组中 DNA 相互作用位点的一 种全基因组定位方法。
实验步骤为：
①
用甲醒固定细胞
②
③ ④
超声破碎细胞
特异抗体通过免疫沉淀富集与目的蛋白质交联的DNA片段 解交联
ChIP on chip
(3) 染色质的免疫沉淀 z 利用目的蛋白质特异抗体通过 抗原 - 抗体反应形成 DNA 蛋白质抗体复合体，然后沉 淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段; 抗体的量要进行优化，防止非特异的结合，同时要 设立相应的阴性对照，以验证抗体的有效性和抗原 抗体反应的特异性。
ChIP技术的步骤
(4)解除交联和纯化DNA:在免疫沉淀复合体中加入不 含 DNase 的 RNase 和蛋白酶 K(也可以不加蛋白酶 K. 解除交联后回收 DNA. 蛋白还可用于做进一步的分 析 ). 65 ℃保温 6小时使交联解除，得到 DNA. 并进 行DNA的纯化。 (5) DNA的检测:可以采用PCR、Southern杂交、ChIP 克隆、DNA芯片等方法进行DNA的检测。
ChIP-Seq
ChIP-Seq技术将ChIP与第二代测序技术相结合，能够高效地 在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段。
其原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富 集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建 ; 然后对富集得到的 DNA 片段进行高通量测序；最后将获得 的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基 因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
染色体免疫共沉淀技术 DNA甲基化分析技术
染色体免疫共沉淀技术
染色体免疫共沉淀 (chromatin immunoprecipitation. ChIP)是基于体内分析发展起来的方法，也称结合 位点分析法，可用于测定体内结合在特定 DNA序列 上的蛋白质。该方法主要应用于体内核小体定位、 DNA甲基化、组蛋白修饰等方面的研究。
研究方法：⑪甲基化敏感的限制性内切酶法 ⑫重亚硫酸盐的甲基化分析方法
研究目的：⑪基因组整体水平甲基化分析
⑫特异性位点的DNA甲基化检测
⑬甲基化新位点的寻找
DNA甲基化分析技术
研究方法：⑪甲基化敏感的限制性内切酶法
一些限制性内切酶的识别位点中含有CpG双核苷酸序列，他们 往往只能结合非甲基化的识别序列，而对发生甲基化的序 列则没有结合活性。 这种方法不仅可以用来检测某个基因或DNA序列的甲基化状态， 而且可以用作整个基因组甲基化状态的筛查。 在这个原理基础上设计的研究方法有： RLGS (restriction landmark genome scanning，限制性标 志物全基因组扫描 ) 、 DMH (differential methylation hybridization for methylation analysis.差异性甲基 化杂交分析)、MCA Cmethylation CpG island amplification for methylation analysis ，甲基化CpG 岛扩增子分析)
其中使用甲醛作为交联剂的关键优势在于甲醒交联反应是 完全可逆的，便于在后续步骤中分别对 DNA 和蛋白质进行 分析。也可以使用紫外光作为交联剂来固定细胞，它比化 学交联剂产生更少的干扰，但难以广泛应用。
ChIP技术的步骤
(2) 化学 ( 微球菌酶 ) 或者超声破碎断裂染色质: 通常采 用超声波打断染色质，使其成一定大小的片段。目 前一般认为500-1000bp的大小范围是比较合适的。
②免疫化学法
此方法基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应的原理。应用荧光素 标记抗体使之与预先己固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜 上的荧光素进行扫描得到 5mC的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。 这种方法较为灵敏但需要精密仪器。
染色体免疫共沉淀技术
染色质免疫沉淀技术的原理是 :在生理状态下把细胞 内的DNA与蛋白质交联在一起，超声破碎将染色质 随机切断为一定长度范围内的染色质片段，用所 要研究的目的蛋白特异性抗体沉淀交联复合体， 再经过蛋白质与DNA解除偶联，纯化目的片段并检 测。
ChIP技术的步骤
(1)细胞固定:在活细胞状态下，用甲醒固定蛋白质 DNA复合 物，甲醒能有效地使体内的蛋白质 - 蛋白质、蛋白质 -DNA 、 蛋白质-RNA产生交联。
DNA甲基化分析wenku.baidu.com术
⑫重亚硫酸盐的甲基化分析方法
其原理是：用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催 化下处理DNA可使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨反应， 从而转变成尿嘧啶 (U), 而甲基化的胞嘧啶不能发 生脱氨反应，因而仍保留为胞嘧啶。
DNA甲基化分析技术
研究目的：⑪基因组整体水平甲基化分析
①高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
DNA甲基化分析技术
DNA甲基化是表现遗传学的重要组成部分，在维持正 常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤 发生中起着重要作用。随着对甲基化研究的不断 深入，其检测方法也层出不穷。这些方法针对不 同研究目的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了 从基因到基因组各个层次水平的研究。
DNA甲基化分析技术
⑤
用LM-PCR扩增富集的DNA片段并用荧光染料(Cy5)进行标记; 未经免疫沉淀富集的 DNA 片段也用 LM-PCR 扩增，但是用另 一种荧光染料(Cy3)标记扩增产物。 将这两组标记的DNA与一张含有全基因序列的 DNA芯片进行 杂交。
⑥
⑦
从 3 次独立的实验获得的免疫沉淀富集的荧光强度与未经 免疫沉淀富集的荧光强度的比值用加权平均分析法计算目 的蛋白质与芯片中的每一段序列的相对结合度。
ChIP on chip
ChIP on chip将ChIP操作与基因芯片技术分析法(chip)相结 合，是研究目的蛋白质与基因组中 DNA 相互作用位点的一 种全基因组定位方法。
实验步骤为：
①
用甲醒固定细胞
②
③ ④
超声破碎细胞
特异抗体通过免疫沉淀富集与目的蛋白质交联的DNA片段 解交联
ChIP on chip
(3) 染色质的免疫沉淀 z 利用目的蛋白质特异抗体通过 抗原 - 抗体反应形成 DNA 蛋白质抗体复合体，然后沉 淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段; 抗体的量要进行优化，防止非特异的结合，同时要 设立相应的阴性对照，以验证抗体的有效性和抗原 抗体反应的特异性。
ChIP技术的步骤
(4)解除交联和纯化DNA:在免疫沉淀复合体中加入不 含 DNase 的 RNase 和蛋白酶 K(也可以不加蛋白酶 K. 解除交联后回收 DNA. 蛋白还可用于做进一步的分 析 ). 65 ℃保温 6小时使交联解除，得到 DNA. 并进 行DNA的纯化。 (5) DNA的检测:可以采用PCR、Southern杂交、ChIP 克隆、DNA芯片等方法进行DNA的检测。
ChIP-Seq
ChIP-Seq技术将ChIP与第二代测序技术相结合，能够高效地 在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的 DNA 区段。
其原理是:首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富 集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建 ; 然后对富集得到的 DNA 片段进行高通量测序；最后将获得 的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基 因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
染色体免疫共沉淀技术 DNA甲基化分析技术
染色体免疫共沉淀技术
染色体免疫共沉淀 (chromatin immunoprecipitation. ChIP)是基于体内分析发展起来的方法，也称结合 位点分析法，可用于测定体内结合在特定 DNA序列 上的蛋白质。该方法主要应用于体内核小体定位、 DNA甲基化、组蛋白修饰等方面的研究。
研究方法：⑪甲基化敏感的限制性内切酶法 ⑫重亚硫酸盐的甲基化分析方法
研究目的：⑪基因组整体水平甲基化分析
⑫特异性位点的DNA甲基化检测
⑬甲基化新位点的寻找
DNA甲基化分析技术
研究方法：⑪甲基化敏感的限制性内切酶法
一些限制性内切酶的识别位点中含有CpG双核苷酸序列，他们 往往只能结合非甲基化的识别序列，而对发生甲基化的序 列则没有结合活性。 这种方法不仅可以用来检测某个基因或DNA序列的甲基化状态， 而且可以用作整个基因组甲基化状态的筛查。 在这个原理基础上设计的研究方法有： RLGS (restriction landmark genome scanning，限制性标 志物全基因组扫描 ) 、 DMH (differential methylation hybridization for methylation analysis.差异性甲基 化杂交分析)、MCA Cmethylation CpG island amplification for methylation analysis ，甲基化CpG 岛扩增子分析)
其中使用甲醛作为交联剂的关键优势在于甲醒交联反应是 完全可逆的，便于在后续步骤中分别对 DNA 和蛋白质进行 分析。也可以使用紫外光作为交联剂来固定细胞，它比化 学交联剂产生更少的干扰，但难以广泛应用。
ChIP技术的步骤
(2) 化学 ( 微球菌酶 ) 或者超声破碎断裂染色质: 通常采 用超声波打断染色质，使其成一定大小的片段。目 前一般认为500-1000bp的大小范围是比较合适的。
②免疫化学法
此方法基于单克隆抗体能够与5mC发生特异性反应的原理。应用荧光素 标记抗体使之与预先己固定在DEAE膜上的样品DNA特异性结合，对DEAE膜 上的荧光素进行扫描得到 5mC的水平，其荧光素强度与5mC水平成正比。 这种方法较为灵敏但需要精密仪器。
染色体免疫共沉淀技术
染色质免疫沉淀技术的原理是 :在生理状态下把细胞 内的DNA与蛋白质交联在一起，超声破碎将染色质 随机切断为一定长度范围内的染色质片段，用所 要研究的目的蛋白特异性抗体沉淀交联复合体， 再经过蛋白质与DNA解除偶联，纯化目的片段并检 测。
ChIP技术的步骤
(1)细胞固定:在活细胞状态下，用甲醒固定蛋白质 DNA复合 物，甲醒能有效地使体内的蛋白质 - 蛋白质、蛋白质 -DNA 、 蛋白质-RNA产生交联。
DNA甲基化分析wenku.baidu.com术
⑫重亚硫酸盐的甲基化分析方法
其原理是：用重亚硫酸氢钠在碱性条件和氢醌的催 化下处理DNA可使非甲基化的胞嘧啶发生脱氨反应， 从而转变成尿嘧啶 (U), 而甲基化的胞嘧啶不能发 生脱氨反应，因而仍保留为胞嘧啶。
DNA甲基化分析技术
研究目的：⑪基因组整体水平甲基化分析
①高效液相色谱柱（HPLC）及相关方法
DNA甲基化分析技术
DNA甲基化是表现遗传学的重要组成部分，在维持正 常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤 发生中起着重要作用。随着对甲基化研究的不断 深入，其检测方法也层出不穷。这些方法针对不 同研究目的，运用不同的处理方法，几乎涵盖了 从基因到基因组各个层次水平的研究。
DNA甲基化分析技术
⑤
用LM-PCR扩增富集的DNA片段并用荧光染料(Cy5)进行标记; 未经免疫沉淀富集的 DNA 片段也用 LM-PCR 扩增，但是用另 一种荧光染料(Cy3)标记扩增产物。 将这两组标记的DNA与一张含有全基因序列的 DNA芯片进行 杂交。
⑥
⑦
从 3 次独立的实验获得的免疫沉淀富集的荧光强度与未经 免疫沉淀富集的荧光强度的比值用加权平均分析法计算目 的蛋白质与芯片中的每一段序列的相对结合度。