第十二章分子定向进化定向育种
定向进化及群体遗传学研究
定向进化及群体遗传学研究进化论是生物学的基本理论之一，其核心思想是物种的进化是由基因的频率随着时间的推移而改变的。
在物种进化的过程中，定向进化是其中的一种形式。
定向进化是一种进化方向受限的进化形式，是指物种在特定的环境条件下，基因频率会朝着特定的方向发展，从而导致物种自身发生了一系列的适应性改变。
在定向进化的过程中，群体遗传学则是其中用于研究的基础方法之一。
群体遗传学是研究群体遗传结构和演化的学科，其研究的主要对象是从分子、细胞到群体层次上的遗传变异、变异与增殖的关系。
在群体遗传学中，基因频率的改变是群体进化的核心，其中遗传漂变、基因流、自然选择等因素影响并塑造物种的遗传多样性。
群体遗传学是定向进化研究的重要工具，在研究定向进化的过程中发挥着重要的作用。
定向进化的一个典型例子就是飞蛾的色素变化。
在英国的18世纪中叶，由于黑色树皮的覆盖，飞蛾的身体颜色逐渐从白色转变为了黑色，许多白色飞蛾的数量显著减少，而黑色飞蛾的数量显著增加。
这里的群体遗传学研究表明，飞蛾群体的黑色基因频率随着时间的推移而不断增加，这种变异终于导致了一种黑色的天蛾出现。
这个例子说明了在特定环境下，基因频率会朝着某个方向进行改变，进而导致物种的进化。
在群体遗传学中，群体的大小和基因频率的改变关系密切。
当群体较小时，其基因频率可以被随机漂移影响，而影响群体进化方向的自然选择和基因流的效应则较小。
在大型群体中，自然选择和基因流将成为更重要的因素，它们会对基因频率进行更强烈的塑造，并为物种的进化打开了更多的可能性。
由于群体遗传学在定向进化研究中有重要的应用，这个领域正在不断地发展。
随着技术的进步，对多种生物信息学的研究和数据分析能力的提高，今后研究人员将有机会更深入地研究物种进化和变异的机制，更好地理解群体的演化规律，从而使其成为保护生物多样性和环境可持续性的重要工具。
总之，定向进化是物种进化的一种重要形式，它受到许多内外环境因素的影响。
微生物育种资料名词解释1．富集培养目的微生物含量较少时，根据
微生物育种资料名词解释1．富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利生长条件，是目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由劣种变为优势种，以利用分离所需要的菌种。
2．营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺失的营养因子才能生长。
3．常规杂交育种：通过接合、转化、转导、溶源转化和转染等方式来获得重组体的杂交育种方法。
4．原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后，制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可以打破种属间遗传障碍。
获得远缘杂交重组体的特殊方式。
5．原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。
6．原生质体诱变育种：以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
解答1．工业生产的微生物菌种的特性①在遗传上必须是稳定的②易于产生许多营养细胞、包子或其他繁殖体②必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体④种子的生长必须旺盛、迅速⑤产生所需要的产物时间短⑥比较容易分离提纯⑦有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强⑧能保持较长的良好经济性能⑨菌株诱变处理较敏感，从而可以选育出高产菌株⑩在规定时间内，菌株必须产生与其数量的目的产物，并保持相对地稳定2．工业微生物的发展史（1）诱变育种。
以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的变异株，并找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最是环境条件下合成有效产物。
（2）杂交育种。
使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种的育种方法。
（3）代谢控制育种。
进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累由于产物的目的，定向选育包括改变代谢代谢通路；降低支路代谢终产物产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜通透性。
《分子育种》课件
《分子育种》课件一、教学内容本节课的教学内容来自于小学科学五年级下册第五单元第一课时《分子育种》。
本节课的主要内容是让学生了解分子育种的基本概念，掌握分子育种的基本方法，以及了解分子育种在农业生产中的应用。
二、教学目标1. 让学生了解分子育种的基本概念，掌握分子育种的基本方法。
2. 让学生了解分子育种在农业生产中的应用，提高学生的实践能力。
3. 培养学生热爱科学，关注农业生产的情感态度。
三、教学难点与重点重点：让学生了解分子育种的基本概念，掌握分子育种的基本方法。
难点：让学生了解分子育种在农业生产中的应用。
四、教具与学具准备教具：PPT课件、黑板、粉笔。
学具：课本、笔记本、彩笔。
五、教学过程1. 情景引入：教师通过播放一段关于农业生产的视频，引导学生关注农业生产中的科技应用。
2. 讲解分子育种的基本概念：教师通过PPT课件，讲解分子育种的基本概念，让学生了解分子育种的基本原理。
3. 讲解分子育种的基本方法：教师通过PPT课件，讲解分子育种的基本方法，让学生掌握分子育种的基本技巧。
4. 案例分析：教师通过PPT课件，展示一些分子育种在农业生产中的应用案例，让学生了解分子育种的实际应用。
5. 随堂练习：教师通过PPT课件，给出一些关于分子育种的问题，让学生进行随堂练习，巩固所学知识。
6. 作业布置：教师通过PPT课件，布置一些关于分子育种的作业，让学生课后巩固所学知识。
六、板书设计板书设计如下：分子育种基本概念→ 基本方法→ 应用案例七、作业设计1. 题目：请简述分子育种的基本概念。
答案：分子育种是指通过分子生物学技术，对生物体的基因进行改造，以达到改良生物品种的目的。
2. 题目：请列举两种分子育种的方法。
答案：基因重组、基因编辑。
3. 题目：请举例说明分子育种在农业生产中的应用。
答案：转基因抗虫棉、转基因抗病水稻。
八、课后反思及拓展延伸课后反思：本节课通过讲解分子育种的基本概念、基本方法和应用案例，让学生了解了分子育种的相关知识。
分子定向进化
分子定向进化是指模仿自然进化过程的策略，通过人为操作实现分子的改造。
这种进化方法无需预先了解蛋白质的结构和作用机制，即可获得具有特定功能或全新功能的蛋白质或DNA。
定向进化通常从靶基因或一组相关家族基因或DNA 开始，通过突变或重组等手段创建分子的多样性，然后对多样性文库进行筛选，以获得具有新功能的基因或DNA。
定向进化可以在试管中模拟达尔文进化过程，按需施加选择压力，以筛选出具有期望特征的蛋白质，从而在分子层面上实现模拟进化。
这种方法已被广泛用于改善蛋白质性能，比如改进蛋白质药物的稳定性、半衰期、免疫原性，开发酶的新底物利用以及改进或拓展新的代谢途径等。
定向进化常用的策略包括易错PCR技术，这种方法对于建立任意核苷酸序列文库或在表达及筛选过程引入突变同样有用。
分子育种PPT课件
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（四）不完全配对的低聚核苷酸介导法
以上的碱基取代都是在双链DNA分子的某个单 链区域进行的。在双链DNA上要利用限制酶来 切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代 只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作 用使上述方法具有一定的局限性。
说明：lipase脂肪酶，esterase酯酶，triglyceride三甘油酯，Degradation降解， Detergent additives洗涤剂添加剂，hydrolysis水解
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Lipases
Kinetic Resolutions of Chiral Alcohols and Acids
其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子， 甚至是一些生物体中的小分子。
它通过人工合成或借助于重组 DNA技术，人为制造大 量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压 力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛 选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。
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定向进化是一个由构建突变体库，突变体表 达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过 程，需要：
变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种 配合该技术的诱变体产量富集法。
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这种方法用具dut和ung基因缺陷的大肠杆菌制 备M13载体。
dut基因编码催化dUTP分解的dUTPase，该基因 缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少 量dUTP代替dTTP掺入DNA。
ung基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失 后，不能除去掺入DNA的dUTP。
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定向进化技术包括：
定点突变（定点的） 易错PCR（随机的） DNA重排（重组的） ……
分子定向进化技术简介
分子定向进化技术
自然进化
分子定向进化
生物在漫长的时 间里经过自发突变 (突变与重组)，通 过自然选择，逐渐 形成了多样性的生 物。
自发、不定向、自然选择、慢
基因在短时间通过 人为引发突变，经 过人工筛选，形成 满足人们需要的新 功能或者优良性能 生物物质(酶蛋白)。
人为、定向、人工选择、快
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分子定向进化技术
一、分子定向进化技术的定义
分子定向进化(molecular directed evolution)是在分子水平研究所需生物的 特定基因或蛋白质，是在体外模拟突变、 重组和选择的自然进化机制，使进化朝 着人们需要的方向发展其实质，是达尔 文进化论在分子水平上的延伸和应用。
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分子定向进化技术
二、分子定向进化技术的过程原理
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分子定向进化技术
质粒载体系统
优点较小，含有 长片段的重组克隆的群体扩增过程中容易 丢失、转化效率普遍较低，不易长期保存。
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分子定向进化技术突变体基因的筛选特点：筛选方法必须灵敏，可借助相关仪器 实现高通量筛选，一般根据目的基因表达的 靶蛋白选择筛选的方法
分子定向进化技术
molecular directed evolution
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分子定向进化技术
主要内容
1 分子定向进化技术的概述及定义 2 分子定向进化技术的原理 3 分子定向进化技术具体过程 4 分子定向技术的应用及展望
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分子定向进化技术
概述
人们试图利用结构生物信息学和定 点突变技术对蛋白质进行合理的改造， 这些方法难度较大且要在了解蛋白质的 三维空间的基础上才能进行。而分子定 向进化技术是在不需了解相关蛋白的三 维空间结构的情况下在体外模拟自然进 化的过程(随机突变、重组和选择)，使 基因发生大量变异，并定向选择出所需 性质或功能的蛋白。
完整版分子育种PPT课件
因此，利用dut – ung -菌株制备的M13载体中， 大约1%的T被U取代。
以这样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介 导的定点突变，然后将得到的双链DNA转化到 dut+ung+菌株中，最初的含UU的模板会被降解， 而突变链则因不含U被复制。
利用不完全配对的低聚核苷酸介导法可以克服 上述局限性。
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这种方法的具体操作是：在进行DNA处理前，先测定 DNA的序列，根据诱变点附近的碱基排列顺序合成一段 13个碱基左右的低聚核苷酸片段，低聚核苷酸与待诱变 位点不配对但与诱变点两侧完全配对。
将DNA分子克隆在噬菌体M13载体上变为单链后，与低 聚核苷酸片段相混合，使该片段与DNA的相应部分发生 “退火粘合”。
“Kazlauskas’ Rules”
H OH ML
H O H
ML
H O 2CH LM
M e
C 6H 13 C O O R C 6H 5
O H
M e
R = C20H42, C12H26 45 % Conversion,
42 % Conversion,
97 % ee
97 % ee
Industrial Applications L-menthol
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(1)开创DNA单链区
点诱变要在DNA单链上进行。 首先在双链的目的DNA分子上某个限制酶切点附近开创
出一小段单链区域。 常用的方法有两种：
一是先用溴化乙锭与DNA结合，再用限制酶切开一个裂口 （gap），双链DNA中一条链仍保持完整。而后可用核酸酶Exo III来开创出一个单链区域。
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定向进化技术包括：
定点突变（定点的） 易错PCR（随机的） DNA重排（重组的） ……
分子定向进化
基因组改组重组几个菌株同源染色体可以提 高整个生物体的活性。该方法已用于生物修复中 五氯酚的降解，Dai等通过三轮基因组改组将
Sphingobilum chlorophenolicum对剧毒杀虫剂
五氯苯酚的耐受浓度提高了10倍以上,并可将培 养基中所含的3mmol·L-1五氯苯酚完全降解。
Vezina等借助DNA家族改组技术探索了苯双加氧 酶BPDOs底物的立体专一性和结构之间的关系,获得 了对2,2’-CB(2,2’-二氯联苯)中C5和C6的氧化活 性提高的新酶S100、S149和S151。其中,S100还能催 化2,2’-CB得到顺-5,6-二氧-5,6-二羟基-2,2’-二 氯联苯,而且能降解一些其野生型双加氧酶所不能降 解的苯、甲苯类单环芳香化合物,扩大了酶的底物范 围。
Crameri等通过DNA shuffling技术来改造砷抗性基因, 通过三轮的改组和筛选,得到了对砷的抗性提高40倍的突 变体,虽然在还原酶的基因里并未发现突变,但还原酶的活 性提高了近10倍,推测可能是侧翼序列突变引起的。
Suenaga等在序列分析的基础上,结合推理设计,构建 了12个定点的bphA1突变,其中3个突变酶改变了多氯联苯 复合物的降解特异性区域。尤其是Ile335Phe突变体在提 高了降解多氯联苯的能力外,还具备了降解2,3-双加氧酶 和3,4-双加氧酶的活性。
Keenan等还获得了活性提高11、14、15倍的萘双加氧 酶,另外在单加氧酶的功能改进方面取得了较好的进展。
3、DNA家族改组
Crameri等于1998年首次提出“DNA家 族改组”的概念。他们发现,采用传统的 DNA改组方法虽然能完成定向进化的目的, 但其中随机产生的多为点突变,且有益突 变频率低,导致筛选工作艰巨且进展缓慢。
分子定向进化
分子定向进化
分子定向进化是一种利用分子生物学技术进行生物进化的方法。
它通过改变DNA序列来创造新的蛋白质、酶或其他生物分子，以实现特定的目标。
这种方法的应用范围广泛，可以用于药物研发、酶工程、农业改良等领域。
在分子定向进化中，首先需要选择一个具有潜力的分子，如酶或抗体。
然后，通过人工改变其DNA序列，引入多样性。
这种多样性可以通过随机突变、DNA重组或基因片段插入等方式引入。
接下来，需要对这些变异体进行筛选，以找到具有所需性能的变异体。
筛选方法通常是设计一种适合特定目标的高通量筛选方法，如酶活性测定、抗体结合实验等。
通过重复这个循环，可以逐步提高所需性能并优化变异体。
分子定向进化的核心是模拟自然选择的过程。
通过引入多样性和筛选，可以在实验室中模拟自然界中的进化过程。
这种方法的优点是速度快、效率高，可以在较短的时间内创造出具有所需性能的分子。
与传统的基因工程方法相比，分子定向进化更加灵活和高效。
分子定向进化的应用非常广泛。
在药物研发中，可以通过分子定向进化来优化药物的效果、改善药物的稳定性和生物利用度。
在酶工程中，可以利用分子定向进化来改善酶的催化活性、稳定性和特异性。
在农业改良中，可以利用分子定向进化来提高农作物的抗病性、耐盐碱性等性状。
分子定向进化是一种强大的工具，可以用于改良生物分子的性能。
它在药物研发、酶工程、农业改良等领域具有广泛的应用前景。
通过模拟自然选择的过程，可以在实验室中创造出具有所需性能的分子，从而推动科学研究和应用的发展。
酶分子定向进化ppt课件
基因家族重排技术的基本过程
基因家族若干同源基因
酶切
DNA随机片断
无引物P
筛选
正突变基因
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步。
小基因 的定向进化。
二 DNA重排技术
• 概念片断，经过不加引物的多次PCR循 环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基 因突变的技术过程。
• 如何利用相对简单的方法以达到对天然酶 的改造或构建新的非天然酶就显得非常有 研究意义和应用前景.
• 1993年,美国科学家Arnold F H首先提出酶 分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改 造或构建新的非天然酶.
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定向进 化的过程。
• 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或 者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在 体外采用易错PCR 、ＤＮＡ重排、基因家 族重排等技术进行人工突变，然后进行定 向选择而获得所需突变体。
• 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则 从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突 变基因出发进行DNA序列的重新排布。
• 2）随机引物体外重组技术
• 采用单链DNA为模板，配合若干条随机序 列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板 不同部分的序列互补DNA小片断，然后除 去模板，这些DNA小片断互为模板和引物 进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获 得全长突变基因。
三基因家族重排技术
• 概念
• 又称为基因家族改组技术，是从基因家族 的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割 成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基 因突变的技术过程。
10 第十四章 分子定向进化育种
（2）DNA shuffling
1994 年 ,Stemmer 在 Nature 发 表 了 一 篇 题 为
Rapid evolution of a protein in vitro
by DNA shuffling 的文章 , 首次提出了 DNA 改
优点:目的基因可插入到噬菌体衣壳蛋白编
码基因内 , 通过噬菌体表面展示技术可方便 地筛选出重组子。 不足之处 : (1)对19种氨基酸须分别设计各 自寡核苷酸引物,费用较大; (2)大肠杆菌宿
主细胞存在自身修复系统 , 因突变修复而难
以筛选出突变子 ; (3) 不适合多点饱和突变。
2、盒式诱变 该法利用一种含有突变靶位 点和特殊酶切位点序列的密 码子盒(codon cassette)来
表型观察选择和筛选:基于细胞生长率和 生存率的筛选方法；或是基于蛋白质突变 体库中酶的催化活性的筛选方法，主要依 据强发色体底物 ( 颜色变化 ) 、易观察的克 隆表现 ( 溶解圈 ) 或荧光产物来筛选突变体。 高通量筛选
第十四章内容总结
1. 简述分子定向进化育种的原理？ 2. 理性定向进化育种利用哪些技术手段， 各有何特点？ 3. 非理性定向进化育种利用哪些技术手段， 各有何特点？ ？
定向进化是近20年发展起来的一项新技术，
是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白 等分子水平上的延伸和应用。它不需要深 入了解蛋白质的结构功能关系，在实验室
条件下人工模拟生物大分子自然进化过程，
在体外对基因进行随机诱变，使基因发生
大量变异，并定向选择出所需性质的突变
体，从而可以在短时间内实现自然界几百
值得指出的是 ,DNA 改组的效果必须由改组后的基
《分子育种》PPT课件(2024)
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导入高产相关基因， 如提高作物氮素利用 效率、增加作物分蘖 数等。
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改善作物品质
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导入优质基因，如提高作物蛋白质含量、改善油脂 组成等。
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通过基因编辑技术，降低作物中有害成分含量，如 减少农药残留、降低重金属含量等。
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利用分子标记辅助选择，选育出符合市场需求的高 品质作物品种。
意义
分子育种可实现基因水平的精准 改良，提高作物产量、品质和抗 逆性，对保障粮食安全具有重要 意义。
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分子育种的发展历程
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初期探索
20世纪80年代，随着分子 生物学技术的兴起，分子 育种开始萌芽。
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技术突破
90年代，转基因技术、基 因编辑技术等取得重大突 破，为分子育种提供了有 力工具。
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利用分子标记辅助选择，快速 筛选具有优良生产性能的畜禽 品种。
通过全基因组关联分析，挖掘 影响畜禽生产性能的遗传变异 ，为育种提供科学依据。
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改善畜禽产品品质
通过分子育种技术改良畜禽产品 的营养成分、风味、口感等品质
特性，满足消费者需求。
利用基因工程技术培育具有特定 功能基因的畜禽品种，生产功能 性畜产品，如低胆固醇鸡蛋、高
通过分子育种技术，可以培育出高产、优 质、抗逆性强的农作物新品种，提高农业 生产效益。
利用分子育种技术，可以培育出生长快、 抗病力强、肉质好的新品种动物，满足人 类对高品质肉类的需求。
生物制药与工业应用
推动精准农业与智慧农业发展
分子育种技术还可以应用于生物制药和工 业领域，如生产药用蛋白、工业酶等。
第九章分子定向进化
一、酶定向进化发展历史
定向进化是近20年发展起来的一项新技术， 是达尔文的进化论思想在核酸、肽或蛋白等分子 水平上的延伸和应用。它不需要深入了解蛋白质 的结构功能关系，在实验室条件下人工模拟生物 大分子自然进化过程，在体外对基因进行随机诱 变，使基因发生大量变异，并定向选择出所需性 质的突变体，从而可以在短时间内实现自然界几 百万年才能完成的进化过程。
进行基因组改组首先需要有一个含有各种不 同正突变的基因组库(例如:通过经典的诱变育 种得到目的性状发生改进的不同的正突变菌株 就构成了所需的基因组库),随后通过原生质体 融合将这些正突变菌株的全基因组进行随机重 组,并筛选目的性状得到进一步改进的菌株来进 行下一轮基因组改组,这样,通过循环多轮的随 机重组可以快速、高效地选育出表型得到较大 改进的杂交菌种。
Crameri等通过DNA shuffling技术来改造砷抗性基因, 通过三轮的改组和筛选,得到了对砷的抗性提高40倍的突 变体,虽然在还原酶的基因里并未发现突变,但还原酶的活 性提高了近10倍,推测可能是侧翼序列突变引起的。
Suenaga等在序列分析的基础上,结合推理设计,构建 了12个定点的bphA1突变,其中3个突变酶改变了多氯联苯 复合物的降解特异性区域。尤其是Ile335Phe突变体在提 高了降解多氯联苯的能力外,还具备了降解2,3-双加氧酶 和3,4-双加氧酶的活性。
二、理性设计
➢ 寡核苷酸引物介导的定点突变 ➢ PCR介导的定点突变 ➢ 盒式突变
点饱和突变技术是通过对目的蛋白的编 码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸 分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。 它不是定点突变技术的简单延伸,而是蛋白质 设计理念的全面升华,广泛地应用于蛋白质改 造及结构—功能关系研究中,并取得了一系列 令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴 定蛋白质功能位点,提高酶比活力,改善酶热 稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性 等多方面性质。
微生物育种资料名词解释富集培养目的微生物含量较少时根据
微生物育种资料名词解释1．富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利生长条件，是目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由劣种变为优势种，以利用分离所需要的菌种。
2．营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺失的营养因子才能生长。
3．常规杂交育种：通过接合、转化、转导、溶源转化和转染等方式来获得重组体的杂交育种方法。
4．原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后，制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可以打破种属间遗传障碍。
获得远缘杂交重组体的特殊方式。
5．原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。
6．原生质体诱变育种：以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。
解答1．工业生产的微生物菌种的特性①在遗传上必须是稳定的②易于产生许多营养细胞、包子或其他繁殖体②必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体④种子的生长必须旺盛、迅速⑤产生所需要的产物时间短⑥比较容易分离提纯⑦有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强⑧能保持较长的良好经济性能⑨菌株诱变处理较敏感，从而可以选育出高产菌株⑩在规定时间内，菌株必须产生与其数量的目的产物，并保持相对地稳定2．工业微生物的发展史（1）诱变育种。
以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的变异株，并找出发挥这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最是环境条件下合成有效产物。
（2）杂交育种。
使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种的育种方法。
（3）代谢控制育种。
进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累由于产物的目的，定向选育包括改变代谢代谢通路；降低支路代谢终产物产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜通透性。
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二、蛋白质（酶）分子定向进化策略
（一）易错PCR技术
是指在体外扩增目的基因时，利用Tag酶的低保真度，同时调 整反应条件，提高镁离子浓度、加入锰离子、改变dNTP的比例浓度等 方法，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因的 随机突变，构成突变库，然后选择或筛选出需要的突变体。关键是控 制目的基因的突变频率。
定向进化的原理
• 在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’→5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
• 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
(六) 酶法体外随机—定位诱变（random and extensive mutagenesis)
P324 273
(七)合成改组 （八）截断状模板重组延伸 （九）退火低核苷酸基因重排 （十）非依赖序列同源性的重组法三、定向进化的筛选方法1、常规的筛选方法
常规的筛选方法通常分为三种：表现型筛选、固相筛选和微培养 板筛选。
1、重叠延伸PCR（over-lap extension PCR) p316
2、大引物突变法(The megaprimer PCR method)
三、盒式突变
盒式突变（cassette mutagenesis)，又称片段 取代法（DNA fragment replacement)，利用目标 基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突 变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段。
理性设计仅适用于三维空间结构、结构和功能关系 比较清楚的蛋白质。
第二节 非理性设计------蛋白质（酶） 分子定向进化技术
非理性设计（directed evolution)：在不了解酶分子结构 信息、结构和功能之间关系的情况下，通过对酶基因的随机 突变和基因片段的重组等的方法来构建酶的突变库，然后通 过高通量筛选来获得有益突变的方法。
第一节 理性设计（rational design)
已知目标蛋白的编码序列以及对应的空间结构、功 能和机制等详细资料，依据所推测的催化部位和催化 机理，对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计， 然后通过取代、插入或缺失核苷酸序列等方法来改变 蛋白质分子中特定的氨基酸，从而获得与酶特性相关 的关键残基和结构原件。
外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是 在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。 在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外 显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。
与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同 源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。
• 定向进化=随机突变+定向选择。前者是人为引发的， 后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起 着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用， 整个进化过程完全是在人为控制下进行的。
定向进化不是定点突变
• 定向进化：突变＋筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 凡是能够引起突变的因素都可以应用于定向进化中突变体 的产生。
• 定点突变：
突变位点是确定的； 突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
一、蛋白质（酶）分子定向进化的发展
20世纪60年代 Sol Spiegelman 及其同事利用噬菌 体Qβ进行初次实验。 1981年Hall BG报道定向改变大肠杆菌K12中的第二半 乳糖苷酶的底物的专一性。 1984年 Eige提出分子进化理论。 1993年Arnold提出的易错PCR和1994年Stemmer提出的 DNA改组技术标志着酶分子定向进化技术趋向成熟。
（四）交错延伸重组
交错延伸（stagger extension process, StEP）原理的核心是， 在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时 间，从而只能合成出非常短的新生链，在复性时与不同的模板配对， 则延伸反应所合成的DNA片段就包含了不同模板DNA的信息。这种交 错延伸过程继续进行，直到获得全长的基因。
1994年，Stemmer等首先发表了题为“用DNA shuffling技术体外 快速进化蛋白”的论文 ，奠定了其理论基础，随着改进和补充， 目前已形成了较为完善的技术路线。
2002年 Stemmer等在Nature上发表了“不同基因来源DNA 家族 shuffling加速定向进化”将四种微生物的头孢菌素酶基因进行 了家族shuffling 实验。
具体表现形式：定点突变或区域性突变
一、寡核苷酸引物介导的定点突变
是由加拿大的生物化学家 Michael Smith 1932年提出的
1、寡核苷酸引物介导的定点突变的原理和 方法
原理：p314
方法：p314
2、改良后寡核苷酸引物介导的定点突变方法 简易定点突变技术：p315 优点： p315
二、PCR介导的定点突变
由于在易错PCR的方法中，遗传变化只发生在单一DNA分子内 部，所以属于无性进化（asexual evolution)
连续易错PCR（sequential error-prone PCR)
过程：双链DNA变性（解链；85－95℃） 引物与单链DNA结合（退火；50－70℃ ） 引物延伸（半保留复制； 70－75℃ ）
酶分子定向进化技术(molecular directed evolution of enzyme) 属于蛋白质非理性设计的主要范畴。
酶分子定向进化：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择） 在体得到具有优良催化特
性的酶的突变体的技术过程。
2、噬菌体展示技术（Phage display）
噬菌体展示技术一般使用丝状噬菌体，它是将外源基因插入到噬 菌体展示载体上，并使其与编码噬菌体外壳蛋白基因相连接，从而使 外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌 体表面，被展示的多肽蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。
四、酶分子工程的应用和发展前景
条件：增加Mg2＋（稳定非互补的碱基对） 添加Mn2＋（降低聚合酶的特异性） 4种底物的浓度不平衡
（dATP/dTTP/dCTP/dGTP)
（二）DNA改组技术(DNA shuffling)
将已获得的不同基因中的正突变结合在一起构成突变基因 库。DNA改组又称有性PCR，常规操作过程是对正突变基因库中的 DNA片断用脱氧核糖核酸酶（DNase I）随机切割得到的随机片断， 经过不加引物的多次PCR循环（无引物PCR），导致不同基因的片 段之间的重组。该策略将亲本基因群中的优势尽可能的组合在一 起，最终产生酶分子某一性质的进化，或是两个或更多性质的结 合。所以在理论和实践上，都优于无性进化的策略。
天然酶：娇嫩
分子酶工程研究热点：
1、利用基因工程技术大量生产酶制剂； 2、通过基因定点突变技术和酶分子定向进化技术对 天然酶蛋白进行改造； 3、通过基因和基因片段的融合构建具有多功能的融 合酶。
改造方法： 1、理性设计（rational design) 2、非理性设计(directed evolution)(又称为定向进化）
产生透明圈，有荧光或强光吸收的产物。如果测定的方法对细 胞有毒性或是需要细胞裂解，可将克隆细胞转移到滤膜上进行测定。 最近几年，数字成像技术开始运用到这一领域。这一技术已成功地 运用于高通量筛选和大量信号的评估。数字成像技术可以评估单个 菌落所表达酶的Vmax，而且使用先进的系统每天可以筛选高达105个 克隆。
1、提高酶分子的催化活性 2、提高酶分子的稳定性 3、酶分子对底物专一性的定向改造
本章练习题
1、名词解释 理性设计（rational design） 非理性设计（directed evolution）
重叠延伸PCR 大引物突变法 盒式突变 易错PCR技术 DNA改组 外显子改组 随机引物体外重组 2、问答 1）简述寡核苷酸介导的定点突变的原理及过程 2）改良后的寡核苷酸介导的定点突变原理及过程，与未改良的方法相比 较有什么优点 3）随机引物体外重组与不同 6）请你利用所学的改组方法，筛选一株，高产耐热、耐碱的淀粉酶细菌 菌株（写明方法的名称，原理，具体步骤，筛选方法，结果）
（五）随机引物体外重组(random
priming invitro recombination,RPR)
随机引物体外重组法是用一套随机序列引物,产生互补 于模板不同位置的短DNA片段库(由于碱基错配,这些短DNA片 段也含有少量的点突变).然后进行类似于DNA shuffPR具有以下优点: a、可用单链DNA或mRNA为模板.且对模板量要求少,大大降低 了亲本组分,便利筛选. b、克服了DNA shuffling中DNase所具有的序列偏爱性,保证 了子代全长基因中突变和交叉的随机性. c、片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容,组装前无 需纯化操作. d、随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制,便利了小肽的 改造.
第十二章 分子定向进化育种
分子定向进化技术：人为地创造特殊的进化条件，模拟自然 进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经 存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的 突变和重组，构造一个人工突变酶库，通过一定的筛选和选 择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶。
通过Байду номын сангаасDNA分子的改造，从而改变酶的特性和 功能的育种方法。
原理：DNA片段互为模板和引物，进行扩增和延伸 时碱基序列会重新排布而形成众多的突变基因，分 离出全长突变基因后再进行常规PCR扩增以进行定向 选择。
结果：将存在于不同基因中的多种正突变结合在一 起。
体 外 定 向 进 化
（三）外显子改组
真核基因转录后内含子被剪切，仅剩下编码序列（外显 子）。在许多基因中，一个外显子编码一个折叠结构域，因此 Gilbert认为内含子间的重组，可使独立的外显子组装成编码新 蛋白的基因，此过程即外显子的改组。现在认为外显子改组是 蛋白进化的重要机制。因此人为模拟此自然进化过程来定向进 化酶分子成为一个很具吸引力的途径。