利用激光共聚焦扫描显微镜对溃疡病菌侵染柑橘叶片的实时观察

利用激光共聚焦扫描显微镜对溃疡病菌侵染柑橘叶片的实时观

察

赵亚;马先锋;肖翠;刘利平;李娜;邓子牛

【摘要】柑橘溃疡病对柑橘产业造成了巨大损失,而研究柑橘与溃疡病菌的互作关系以及柑橘的感病和抗病性均需要观察溃疡病菌在柑橘寄主中的侵染和定殖过程.激光共聚焦扫描显微镜不仅可以观察活细胞,活组织的动态代谢过程,而且可以获得三维图像,对于病原菌在柑橘植物组织内的繁殖和致病机制研究具有重要意义.但是,选择适宜的植物材料和制片方法对激光共聚焦扫描显微镜的观察效果影响很大.本文对激光共聚焦扫描显微镜所观察的材料在其处理和观察方法上加以改进,获得了质量更好的图片和实验结果,也使得实验更为方便快捷.激光共聚焦扫描显微观察还在瞬时表达分析中得到应用,提高了柑橘瞬时表达分析的效果.通过将切片和压片相结合观察到溃疡病菌在不同时间点对柑橘叶片的侵染情况,而通过3D建模能观察到柑橘叶片不同组织层面中的病菌数量和病菌位置,为研究溃疡病菌在叶片中的定殖方式和入侵数量提供了前期基础.%Citrus canker caused a huge losses to the citrus industry in our country,therefore,the observation of infection and colonization of the pathogen in citrus is indispensable to the research of interaction between citrus and Xanthomonas citri subsp.citri (Xcc) as well as the susceptibility and resistance of citrus.Confocal laser scanning microscopy can as well observe the dynamic metabolism of living cells and living tissues,it can obtain the 3-D image as well,it is of great significance to the study of the propagation and pathogenic mechanism of pathogenic bacteria in citrus tissues.However,the selection of appropriate tissue materials and production methods have great influence on the observation

effect of observations.In this paper,the improvement of material handling and observing methods of confocal laser scanning microscopy was made to obtain better quality images and experimental results;By comparing the old and new two experimental methods,more convenient and efficient experimental method was got;The effect of transient expression analysis of citrus was improved by the application of confocal laser scanning microscopy.The process of the infection of citrus leaf by Xcc at different time points was preliminaryly studied by combining the section and tabletting methods and the number of bacteria and germs in different levels of organization are observed by 3D model,which provide the basis for the study of bacterial canker in leaf colonization and invasion quantity.【期刊名称】《激光生物学报》

【年(卷),期】2017(026)002

【总页数】8页(P143-150)

【关键词】激光共聚焦显微镜;柑橘溃疡病菌;入侵

【作者】赵亚;马先锋;肖翠;刘利平;李娜;邓子牛

【作者单位】湖南农业大学园艺园林学院, 国家柑橘改良中心长沙分中心, 湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院, 国家柑橘改良中心长沙分中心, 湖南长沙410128;湖南农业大学园艺园林学院, 国家柑橘改良中心长沙分中心, 湖南长沙410128;湖南农业大学园艺园林学院, 国家柑橘改良中心长沙分中心, 湖南长沙410128;湖南农业大学园艺园林学院, 国家柑橘改良中心长沙分中心, 湖南长沙

410128;湖南农业大学园艺园林学院, 国家柑橘改良中心长沙分中心, 湖南长沙410128

【正文语种】中文

【中图分类】S182

激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy, CLSM)是近十年发展起来的生物学图像分析仪器，与传统的光学显微镜相比，大大地提高了分辨率，能得到真正具有三维清晰度的原色图像[1], 可探测低对比度或弱荧光样品。通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光，能动态测量影响细胞代谢的各种生理指标，对细胞动力学研究有着重要意义[2]。同时用激光共聚焦扫描显微镜观察活体标本，不会对标本造成物理化学特性的破坏，更接近细胞生活状态参数测定[3]。可见激

光共聚焦扫描显微镜与普通显微镜比较，性能有显著提高，在细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。

柑橘溃疡病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是一种影响全球柑橘产业发展的重大病害,其病原菌为柑橘黄单胞杆菌柑橘变种(Xanthomonas citri susp. citri，Xcc)[4]。溃疡病菌在寄主表面成功附着后,为了能够致病,必须侵入植物组织。因此，病原菌入侵寄主的过程是致病的关键环节，对溃疡病的防治和抗病品种的选育都具有重要意义。之前大多数报道认为，柑橘溃疡病菌通过自然孔口(气孔、皮孔)或伤口(机械伤口、虫伤口)侵入寄主组织[5]。在我们前期的观察中发现，细菌

在柑橘叶表面是随机分布的，并没有表现对气孔的特异趋向[6]。那么溃疡病菌是

如何进入植物组织内部的？是通过自然开口进入植物内部的[7]还是直接穿过表皮

进入叶肉组织的，或者两者有之，目前还没有确切的证据，其机制更不清楚。

在植物病理学诊断研究中，广泛应用多维显微镜观察法，即利用激光共聚焦扫描显微镜技术从三维空间观察植物病原菌和寄主植物各自的亚细胞结构特征，以及两者