内蒙古大学基因工程大实验思考题

内蒙古大学基因工程大实验思考题

本科生基因工程实验(记录及课后思考题)

姓名:

学号:

专业:

完成日期:2012年9月9日

指导老师:

一、质粒DNA的小量制备

1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？

①与菌的生长状况有关

②和提取时的温度有关，需要低温

③加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和

④要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质

⑤要用冰乙醇沉淀

2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避

免蛋白质的污染？

加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。

二、质粒DNA电泳鉴定

1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？

质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。通常观察到的是超螺旋和环状质粒。

2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？

在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同

3.影响本实验结果的因素有哪些？

DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。

三、质粒DNA的酶切

1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？

有影响

加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

2.如何估计DNA用量和酶的用量？

DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000

1U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。

3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？

将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。

四、PCR扩增制备目的基因

1.复性温度是根据什么确定的？

可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR 退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含 AT 的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的DNA 模板又重新结合成双链DNA，从而导致PCR 的失败。非特异性条带数增多。

2.引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？

根据cDNA设计引物，为了更好地与载体连接。

3.为什么要在最后延伸10min？

一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。

4.实验中是否有非特异性扩增产物或引物二聚体带？如何才能消除？

有

①.重新设计引物

②加大模板用量或减少引物用量

③扩大反应体系

④提高退火温度或Mg离子浓度

五、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段

1.为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？

紫外照射对DNA有损伤，，为了保证DNA的完整性，尽量不用EB染色或紫外照射。

六、目的基因片段与载体连接

1．连接酶的最适活性温度是多少？

37℃

2．为什么要采用14℃下连接？

由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在14°C下进行

3．如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？

一般参考T4连接酶的说明书，大多数人做的是插入片段：载体=3：1至5：1，是分子数的比值。可以先测出两者的质量浓度（分光光度计或者跑电泳），然后根据分子量大小可以算出。

七、感受态大肠杆菌的制备

1.制作感受态菌的过程中，应注意哪些关键步骤？

①操作是防止污染，这个最容易影响感受态制作的因素。

②悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮。

2.CaCl2溶液的作用是什么？为什么要冰冷的？

作用：悬浮菌体

在0～4℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中

的DNA形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的保存了DNA，冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。

八、感受态细菌的转化

1.影响转化效率的因素有哪些？

①细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是5×107/ml）；

②所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

③经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

④化合物及无机离子的影响：Ca2+的基础上联合其他二价金属离子在（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；

⑤所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

⑥质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ;

⑦一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；

2.白色菌落出现的原理是什么？

由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA 插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。

九、转化克隆的筛选与鉴定

1.PCR法筛选的优点和缺点是什么？

酶切法与PCR法PCR可以直接以菌落做模板，比较方便，但有时候有假阳性；酶切鉴定需要提取质粒才能酶切，比较费时，且插入片