土壤中细菌总数的测定实验

实验四细菌总数的测定——纯种分离
一、目的
1.掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和培养技术。

2.掌握无菌操作技术。

二、材料和器皿
1.扭力天平、取土样工具、涂布棒(接种棒)。

2.无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。

3.无菌水。

4.培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基。

三、实验操作步骤
1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。

先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。

盛土的容器应是无菌的。

将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

土样取回后应尽快投入实验，同时取10-15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。

2、倒平板熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。

3、编号取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10-
3、10-
4、10-
5、10-
6、10-
7。

4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取
4.5mL无菌水于编号的各无菌空试管中。

5.制备土壤稀释液称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。

用无菌移液管吸取悬液
0.5mL于
4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次、摇匀，此即为10-3浓度。

同样方法，依次稀释到10-
7。

稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

环境要求：
琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

代表性：
取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

减少误差：
每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。

6、培养及计数培养条件：
倒置于36±1℃温箱内培养48±2h计数时间：
到达规定培养时间，应立即计数。

如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

计平皿中菌落数：
肉眼观察，必要时用放大镜检查。

记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

规律：
不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。

如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。

当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。

如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。

当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。

再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

计数原则：
选平均菌落数在30~300之间者进行计算
1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。

2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。

3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30
的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。

7.在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。

若片状菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，然后乘以2作为整个平板的菌落数。

报告原则例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌菌落数报告方式10-110-210-3落数之比(个/mL) (个/mL)20—00或
1.6×
295461.000或
3.8×271
602.000或
2.7×1044无法计数—00或
5.1×5—270或
2.7×1026无法计数305 12—00或
3.1×1047无法计数—————10-3无法计数
7、菌落总数报告方式菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。

为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。

固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。

8.计数选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克干土所含菌数。

同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数每克干土含菌数=1－土壤含水量％
四、思考题
1.用一根无菌移液管接种几个浓度的水样时应从哪个浓度开始？为什么？
2.琼脂平板接种后，为什么要倒置培养？。