荧光蛋白
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1
荧光蛋白的发展简史
2
荧光蛋白的结构
3
荧光蛋白的分类
4
荧光蛋白的应用
5
结 论 与 展 望
下村修
• 1962年在维多利亚多管水母体内 发现了绿色荧光蛋白( GFP )，并 进行纯化。
马丁·沙尔菲
• 第一次运用绿色荧光蛋白 这个神奇工具投入试验研 究。
钱永健
• 1994年，改造GFP，使 其荧光变强、变色。
图2.Azurite突变体 图3. EBFP2 突变体
荧光蛋白的应用
• 红色系列荧光蛋白
对于橙色与红色系列荧光蛋白，较早报道的红色荧光蛋白(DsRed)的突变体有 mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。这些以水 果命名的荧光蛋白表现出不同的光谱和理化特性，其中红色荧光蛋白mCherry 成熟 快、单体特性好，已被广泛应用，但它的亮度较低。
mKeima 是最早报道的大 Stokes 位移的红色荧光蛋白， 它的发射与吸收峰分别位于440 和620 nm 处。采用458 nm 的光 源同时激发CFP 与 mKeima 两个 荧光分子，能实现单光源的多色 成像及荧光相关光谱(FCS) 分析。 但 mKeima 有两个激发峰，另一 个在584 nm 处，这不利于它的 多色成像。
图8. PA-GFP的CLSM
图9. Dronpa 光致变色的性质
结论与展望
结论
本文主要介绍了荧光 蛋白的发展，结构及 分类，以及其在亮度、 Stokes 位移、光谱等 特性方面的研究与发 展，在光转换与光激 活荧光蛋白及其在超 分辨荧光成像技术中 的应用。
展望
活体成像深度仍有局 限性，为了提高分辨率， 需要优化出更合适于活 体荧光成像的高亮度近 红外荧光蛋白分子。 新型光学成像技术迫 切需要具备新特性的荧 光分子与之结合，以更 大程度地提高成像的时 空分辨率和检测灵敏度。
荧光蛋白的结构
图1. 野生型avGFP的结构
荧光蛋白的分类
蓝色荧光蛋白 青色荧ຫໍສະໝຸດ 蛋白表1. 部分荧光蛋白及其基本性质
绿色荧光蛋白 黄色荧光蛋白 橙色荧光蛋白
红色荧光蛋白 远红光荧光蛋白
荧光蛋白的应用
1.亮度高的荧光蛋白
荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定,与成 像检测灵敏度密切相关。 • 蓝色荧光蛋白 EBFP 发光较弱，抗光漂白和抗酸性较差， 用于细胞成像时背景信号高。几个课 题组针对EBFP开发了3个更亮的突变体： Azurite，EBFP2，mTagBFP。
图4. 红色荧光蛋白
荧光蛋白的应用
2.可见光光谱两端的荧光蛋白
由于荧光蛋白的发光团结构决定了它的光谱特性，从结构上来设计荧光蛋白的突变位点， 有可能获得可见光光谱两端的荧光蛋白突变体。开发深红色或者近红外荧光蛋白对于活体 生物成像更具价值。由于机体组织内的血红素在可见光波段有强吸收，而水和脂肪在红外 波段有强吸收，仅在近红外光波段(650～900 nm) 的吸收系数最小且自发荧光最弱，被认 为是活体成像的“光学窗口”。
可逆光活化荧光蛋白
Dronpa 来源于Cnidaria，在强的蓝光(470～510 nm) 作用 下荧光淬灭形成暗态的分子。暗态的Dronpa 在390 nm 处 有吸收峰，受到400 nm 左右光照射时发生光活化，可回 到起初的绿色荧光态，这种转化可以反复多次进行。
图7. PA-GFP的光敏化和 活体成像
参考文献
1.Shaner NC,. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2004, 22:1567~1572. 2. Shroff H, Galbraith CG.Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. Proc Natl Acad SciUSA, 2007, 104: 20308~20313. 3. Bates M, Huang B. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science, 2007, 317: 1749~1753. 4.Mena MA, Treynor TP, Mayo SL, Daugherty PS. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. Nat Biotechnol, 2006, 24: 1569~1571. 5. Ai H, Shaner NC, Cheng Z.Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry, 2007, 46: 5904~5910 6.Subach OM, Gundorov IS, Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol, 2008, 15: 1116~1124. 7. Tomosugi W, Matsuda T. An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity.Nat Methods, 2009, 6: 351~353. 8. Kogure T, Karasawa S. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Biotechnol,2006, 24: 577~581. 9. Patterson GH, Lippincott-Schwartz JA. Photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.Science, 2002, 297: 1873~1877. 10.Subach FV, Patterson GH. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods, 2009, 6: 153~159. 11. Ando R, Mizuno H, Miyawaki A. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science, 2004, 306: 1370~1373.
图6. mKeima荧光蛋白
荧光蛋白的应用
4.光转换与光活化荧光蛋白
不可逆光活化荧光蛋白
最早报道的光活化荧光蛋白PA-GFP，属于不可逆光活化荧光 蛋白类。它经过 405 nm 的紫色光激活后，再用488 nm 的光 激发成像，此时的发射光比激活前增强 100 倍，因而光活化 区域与周边未活化区域形成了很高的荧光对比度，为活细胞 内动态研究蛋白质分子的扩散运动提供了有效方法。
通过GFP-Phe66 突变获得了一 个深蓝色的荧光分子，但它的量子 产率太低而无法使用。进一步对其 突变T65Q、Y145G、H148S T203V 位 点后，得到了深蓝色荧光蛋白 Sirius，亮度比GFP-Phe66 提高了 25倍。 图5. 深蓝色荧光蛋白Sirius
荧光蛋白的应用
3.大stokes位移的荧光蛋白
荧光蛋白的发展简史
2
荧光蛋白的结构
3
荧光蛋白的分类
4
荧光蛋白的应用
5
结 论 与 展 望
下村修
• 1962年在维多利亚多管水母体内 发现了绿色荧光蛋白( GFP )，并 进行纯化。
马丁·沙尔菲
• 第一次运用绿色荧光蛋白 这个神奇工具投入试验研 究。
钱永健
• 1994年，改造GFP，使 其荧光变强、变色。
图2.Azurite突变体 图3. EBFP2 突变体
荧光蛋白的应用
• 红色系列荧光蛋白
对于橙色与红色系列荧光蛋白，较早报道的红色荧光蛋白(DsRed)的突变体有 mBanana、mOrange、dTomato、mTangerine、mStrawberry 和 mCherry。这些以水 果命名的荧光蛋白表现出不同的光谱和理化特性，其中红色荧光蛋白mCherry 成熟 快、单体特性好，已被广泛应用，但它的亮度较低。
mKeima 是最早报道的大 Stokes 位移的红色荧光蛋白， 它的发射与吸收峰分别位于440 和620 nm 处。采用458 nm 的光 源同时激发CFP 与 mKeima 两个 荧光分子，能实现单光源的多色 成像及荧光相关光谱(FCS) 分析。 但 mKeima 有两个激发峰，另一 个在584 nm 处，这不利于它的 多色成像。
图8. PA-GFP的CLSM
图9. Dronpa 光致变色的性质
结论与展望
结论
本文主要介绍了荧光 蛋白的发展，结构及 分类，以及其在亮度、 Stokes 位移、光谱等 特性方面的研究与发 展，在光转换与光激 活荧光蛋白及其在超 分辨荧光成像技术中 的应用。
展望
活体成像深度仍有局 限性，为了提高分辨率， 需要优化出更合适于活 体荧光成像的高亮度近 红外荧光蛋白分子。 新型光学成像技术迫 切需要具备新特性的荧 光分子与之结合，以更 大程度地提高成像的时 空分辨率和检测灵敏度。
荧光蛋白的结构
图1. 野生型avGFP的结构
荧光蛋白的分类
蓝色荧光蛋白 青色荧ຫໍສະໝຸດ 蛋白表1. 部分荧光蛋白及其基本性质
绿色荧光蛋白 黄色荧光蛋白 橙色荧光蛋白
红色荧光蛋白 远红光荧光蛋白
荧光蛋白的应用
1.亮度高的荧光蛋白
荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定,与成 像检测灵敏度密切相关。 • 蓝色荧光蛋白 EBFP 发光较弱，抗光漂白和抗酸性较差， 用于细胞成像时背景信号高。几个课 题组针对EBFP开发了3个更亮的突变体： Azurite，EBFP2，mTagBFP。
图4. 红色荧光蛋白
荧光蛋白的应用
2.可见光光谱两端的荧光蛋白
由于荧光蛋白的发光团结构决定了它的光谱特性，从结构上来设计荧光蛋白的突变位点， 有可能获得可见光光谱两端的荧光蛋白突变体。开发深红色或者近红外荧光蛋白对于活体 生物成像更具价值。由于机体组织内的血红素在可见光波段有强吸收，而水和脂肪在红外 波段有强吸收，仅在近红外光波段(650～900 nm) 的吸收系数最小且自发荧光最弱，被认 为是活体成像的“光学窗口”。
可逆光活化荧光蛋白
Dronpa 来源于Cnidaria，在强的蓝光(470～510 nm) 作用 下荧光淬灭形成暗态的分子。暗态的Dronpa 在390 nm 处 有吸收峰，受到400 nm 左右光照射时发生光活化，可回 到起初的绿色荧光态，这种转化可以反复多次进行。
图7. PA-GFP的光敏化和 活体成像
参考文献
1.Shaner NC,. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2004, 22:1567~1572. 2. Shroff H, Galbraith CG.Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. Proc Natl Acad SciUSA, 2007, 104: 20308~20313. 3. Bates M, Huang B. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science, 2007, 317: 1749~1753. 4.Mena MA, Treynor TP, Mayo SL, Daugherty PS. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from a structurally targeted library. Nat Biotechnol, 2006, 24: 1569~1571. 5. Ai H, Shaner NC, Cheng Z.Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry, 2007, 46: 5904~5910 6.Subach OM, Gundorov IS, Conversion of red fluorescent protein into a bright blue probe. Chem Biol, 2008, 15: 1116~1124. 7. Tomosugi W, Matsuda T. An ultramarine fluorescent protein with increased photostability and pH insensitivity.Nat Methods, 2009, 6: 351~353. 8. Kogure T, Karasawa S. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Biotechnol,2006, 24: 577~581. 9. Patterson GH, Lippincott-Schwartz JA. Photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.Science, 2002, 297: 1873~1877. 10.Subach FV, Patterson GH. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods, 2009, 6: 153~159. 11. Ando R, Mizuno H, Miyawaki A. Regulated fast nucleocytoplasmic shuttling observed by reversible protein highlighting. Science, 2004, 306: 1370~1373.
图6. mKeima荧光蛋白
荧光蛋白的应用
4.光转换与光活化荧光蛋白
不可逆光活化荧光蛋白
最早报道的光活化荧光蛋白PA-GFP，属于不可逆光活化荧光 蛋白类。它经过 405 nm 的紫色光激活后，再用488 nm 的光 激发成像，此时的发射光比激活前增强 100 倍，因而光活化 区域与周边未活化区域形成了很高的荧光对比度，为活细胞 内动态研究蛋白质分子的扩散运动提供了有效方法。
通过GFP-Phe66 突变获得了一 个深蓝色的荧光分子，但它的量子 产率太低而无法使用。进一步对其 突变T65Q、Y145G、H148S T203V 位 点后，得到了深蓝色荧光蛋白 Sirius，亮度比GFP-Phe66 提高了 25倍。 图5. 深蓝色荧光蛋白Sirius
荧光蛋白的应用
3.大stokes位移的荧光蛋白