细胞培养基本条件
细胞培养基本条件
细胞培养基本条件1. 细胞培养呀，那环境可太重要啦！就好比人得住在舒服的房子里一样，细胞也需要一个适宜的“家”。
比如说培养箱，温度、湿度都得恰到好处，不然细胞怎么能茁壮成长呢？2. 培养基啊，这可是细胞的“食物”呀！你想想看，要是我们吃的东西不好，能有精神吗？细胞也一样啊！优质的培养基能让细胞活力满满。
就像给宝宝喝最好的奶粉一样重要呢！3. 细胞培养还得注意无菌操作呢！这可不能马虎，就像我们要保持家里干净整洁，不能有细菌滋生。
要是不小心污染了，那可就糟糕啦，细胞可能就全军覆没喽！4. 血清也是很关键的呀！它就像是细胞的“补品”。
你看那些身体虚弱的人需要补一补，细胞也需要血清来补充营养呀。
没有合适的血清，细胞怎么能好好生长呢？5. 传代培养也很有讲究呢！不能随便乱来。
这就好比我们要定期整理房间，把东西归置好。
细胞也需要适时地进行传代，不然它们会太拥挤啦。
6. 培养容器也不能选错呀！这就好像给细胞准备不同大小的碗碟，得合适才行。
合适的培养容器能让细胞舒舒服服地待着。
7. 细胞培养的过程中要经常观察呀！就像妈妈时刻关注宝宝的状态一样。
看看细胞长得怎么样，有没有什么问题，及时发现才能及时解决嘛！8. 培养的时间也得把握好哦！不能太短也不能太长。
这就跟做饭似的，火候掌握不好，饭菜就不好吃。
细胞培养也是这个道理呀。
9. 细胞培养的人得细心又耐心呀！这可不是个简单的活儿。
就像照顾花花草草一样，得精心呵护，它们才能绽放美丽。
细胞也是需要我们用心对待的哟！10. 总之，细胞培养的基本条件一个都不能少！这就像是搭积木，每一块都很重要，少了哪一块都不行。
只有把这些条件都做好了，细胞才能健康生长呀！我的观点结论：细胞培养需要各个方面的精心照料，只有满足了基本条件，细胞才能顺利培养成功。
细胞培养注意事项大全
细胞培养注意事项大全一、细胞培养实验室的基本要求细胞培养实验室必须具备以下设施和基本条件，以确保实验的准确性和可靠性，同时为研究人员提供一个安全、舒适的工作环境。
1.实验室布局：实验室应合理布局，功能明确，便于清洁和消毒。
室内布局包括细胞培养区、仪器设备区、试剂储存区、清洗区、办公区等。
各区域应相对独立，避免交叉污染。
2.实验室温度和湿度：实验室应保持恒定的温度和湿度，通常温度为20-26℃，湿度为40%-60%。
3.空气洁净度：细胞培养对空气洁净度要求较高，建议配备高效空气过滤器（HEPA），确保室内空气洁净。
4.光照和空气流通：实验室应有良好的自然光照或人工照明，同时具备良好的空气流通性。
5.电源和插座：实验室应提供稳定的电源和充足的插座，以满足各种仪器设备的需要。
6.实验台和储存柜：实验台应具备防震、防腐、防火等功能，储存柜应具备防潮、防尘、防霉等功能。
7.清洁和消毒设施：实验室应配备适当的清洁和消毒设施，如紫外线灯、酒精灯、灭菌器等。
8.防护设备：实验员应佩戴防护设备，如实验服、一次性手套、口罩等，以防止细胞培养过程中的污染和交叉污染。
二、细胞培养的基本操作细胞培养是一项技术性很强的工作，需要掌握各种基本操作技能，以保证实验的准确性和可靠性。
以下是细胞培养的一些基本操作。
1.细胞复苏：将冷冻保存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中融化，然后离心洗涤、消化，最后加入新鲜的细胞培养基中。
2.细胞传代：当细胞密度达到一定程度时，将细胞从培养瓶中取出，消化成单个细胞，然后分种到新的培养瓶中继续培养。
3.细胞冻存：将处于对数生长期的细胞消化成单个细胞，然后与冷冻保护剂混合后放入低温冰箱中冷冻保存。
4.细胞观察：定期观察细胞的生长状况，包括生长速度、形态、颜色等方面。
5.细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪对细胞数量进行计数，以评估细胞的生长速度和密度。
6.细胞分离：根据细胞的密度、大小、表面电荷等特性，通过离心、过滤等方法将不同细胞分离出来。
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使期生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1、无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。
因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
2、恒定的温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有也许恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时，细胞所有死亡。
3、气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环，产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。
动物细胞的培养条件和培养基
• 2、合成培养基：优点是成分明确，组分稳定，可 大量生产供应。动物细胞培养中常用的有BME、 MEM、DMEM、HAM F12、RPMI 1640以及 ISOCOV、199和McCoy等。
• 缺点：无法替代一些未知成分。 • 解决途径合成培养基中添加小牛血清，彼此互补
的胎牛血清。
• 血清的作用机制可能为：（1）提供有利于细胞生 长增殖所需要的各种生长因子和激素；（2）提供 有利于细胞贴壁所需要的贴附因子和伸展因子； （3）提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结 合蛋白；（4）提供细胞生长所必须的脂肪酸和微 量元素。
• 3、无血清培养基
• 无血清培养基的优点如下：①提高了细胞培养的可 重复性，避免，避免了由于血清批之间差异的影响； ②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生 物污染的危险；③供应充足、稳定；
动物细胞的培养条件和培养基
• 为了使细胞培养在体外培养成功，需要一些 基本条件：
（1）绝对无菌操作； （2）足够的营养供应，排除有害物质包括极其
微量的离子掺入； （3）适量氧气供应；
（4）随时清除细胞代谢中产生的有害产物； （5）有良好的适于生存外界环境，包括pH、渗透
压和离子浓度等； （6）及时分种，保持合适的细胞密度。
6、空气
二、动物细胞培养基的 种类和组成
• 细胞种系不同对培养基的要求亦有差异，主要 有三类：天然培养基、合成培养基和无血清培 养基。 1、天然培养基：在细胞培养的早期阶段使用的 培养基，主要为来自天然的材料如血浆凝块、 血清、淋巴液、胚胎浸液以及羊水、腹水等。
• 优点：营养价值高 • 缺点：成分复杂、来源有限、成本较高
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
倒 置 显 微 镜
back
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
液 氮 罐
back
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
21.细胞培养的基本条件
移液器
顯微鏡
酶标仪
微孔板震荡器
高速离心机
液氮罐
实验室安全
层流净化细胞培养室管理规则 一级生物安全防护实验室 二级生物安全防护实验室 三级生物安全防护实验室 四级生物安全防护实验室ຫໍສະໝຸດ 层流净化细胞培养室管理规则
我院层流净化细胞培养室设计标准为万级，专供 细胞培养、冻存以及细胞治疗用。层流净化细胞培养 室的总体要求：经济、有序、高效、安全。初步制定 相关制度如下：
成无菌环境。
II级A型生物安全柜:
一种既能使操作造成无菌、 无尘的局部空气环境，保证检验、 检测不受污染，又能保证被研究 的对象（如病菌、细菌等）不外 溢，保护周围环境及操作人员的 安全隔离设备。
该设备可广泛应用于低、中 等危险度（病原体1--3，DNA重 组P1--P3）的临床细菌学，病毒 学、微生物学、组织培养、生物 学及生命科学的研究，加工、检 验部门。
高效过滤器:
高效过滤器是用超细玻璃纤维纸 作滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合 金框、木框及镀锌钢板框组合而成。
特点：具有低阻高效、轻质、容尘 量大等特点，层高的要求，缩小净化 设备静压箱体积等优点。
适用于常温常压常湿条件下环境空 气的净化，尤其适用于需要高效空气 过滤器覆盖率高的净化厂房。
洁净层流罩:
1、准入制度：
1）必须取得实验室相关实验技能考试合格方可进入层流净化室； 2）在本室工作的实验人员应严格遵守本室工作守则，外来人员在进 入净化室工作之前，必须接受培训； 3）没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作； 4）进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。
2、安全制度：
1）层流净化室内必须注意安全用电； 2）谨慎使用酒精灯，不能在有明火的情况下加、换酒精； 3）实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器如CO2孵 箱等要经常注意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修； 4) 离开层流净化室必须断开必要的仪器电源； 5）对不符合层流净化室安全规定的行为主动报告主管老师。
动物细胞培养的基本条件
动物细胞培养的基本条件
1. 培养基，动物细胞培养需要使用含有营养物质的培养基，如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640等。
培养基中通常含有氨基酸、糖类、维生素、无机盐、生长因子和血清等成分，以支持细胞的生长和增殖。
2. 温度，动物细胞通常在37摄氏度的温度下培养，这是因为这个温度符合动物体内的生理条件，有利于细胞的正常生长和代谢活动。
3. pH值，培养基的pH值通常在7.2-7.4之间，这个范围有利于细胞的生长和代谢，维持细胞内外环境的稳定性。
4. 湿度，细胞培养需要在恒定的湿度下进行，通常采用5%二氧化碳培养箱来维持适当的湿度和CO2浓度，以维持培养环境的稳定。
5. 无菌条件，动物细胞培养需要在严格的无菌条件下进行，以避免细胞受到外源微生物的污染，通常在无菌工作台或生物安全柜中进行操作。
6. 细胞密度，在培养过程中，需要控制细胞的密度，避免细胞
过度增殖或过度稀释，通常通过离心和重新悬浮来调节细胞密度。
总的来说，动物细胞培养的基本条件包括适当的培养基、温度、pH值、湿度、无菌条件和细胞密度等因素，这些条件的合理控制对
于维持细胞的生长和稳定的培养环境至关重要。
通过严格控制这些
基本条件，可以有效地进行动物细胞培养实验，为细胞生物学和生
物医学研究提供可靠的实验基础。
第一讲 细胞培养的基本要求
① 天然培养基
天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离
提取的一类培养基，如血浆、血清、淋巴液、鸡
胚浸出液等。组织培养技术建立早期，体外培养
细胞都是利用天然培养基。
但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异
大，因此逐渐为合成培养基所替代。目前广泛使
用的天然培养基是血清。
血清(serum)
血清种类:主要是牛血清，培养某些特殊细胞也用人血
培养基的配制
RPMI-1640/DMEM培养粉 碳酸氢钠 1袋 2.0 g
青、链霉素
加三蒸水 至 1000ml，4℃过夜
各100单位／毫升
过滤除菌。
调节pH值至7.2
加血清（终浓度 10％）
完全培养基的组成
体外培养的细胞直接生活在培养基中，因此培养
基应能满足细胞对营养成分、促生长因子、激素、 渗透压、pH等诸多方面的要求。
基础培养基(1640或DMEM) 血清
80％一95％ 5％一20％
NaHCO3
P.
2.0 －3.7 g/L
各100单位／毫升
S.
HEPES
2.0 －5.98 g/L
血清抑制胰蛋白酶
培养基
细胞的生长需要一定的营养环境，用于维持细胞
生长的营养基质称为培养基，即指所有用于各种 目的的体外培养、保存细胞用的物质，就其本意 上讲为人工模拟体内生长的营养环境，使细胞在 此环境中有生长和繁殖的能力。它是提供细胞营 养和促进细胞生长增殖的物质基础。
无毒、无污染
体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没
液变绿应重新配制。
或干热（160度2小时）
◆ 冲洗 洗涤装置与手工烘干、包装、高压（15磅20分钟）
人免疫细胞培养条件
人免疫细胞培养条件一、人免疫细胞培养的基本条件1. 培养基- 一般使用专门的细胞培养基，如RPMI - 1640培养基、DMEM培养基等。
这些培养基包含多种营养成分，如氨基酸、维生素、无机盐等。
- 为了满足免疫细胞的特殊需求，还需要添加血清。
常用的是胎牛血清（FBS），其含有多种生长因子、激素、黏附因子等，能促进免疫细胞的生长和增殖。
血清的添加比例通常为10% - 20%，但在某些特殊的免疫细胞培养中可能会有所调整。
2. 温度- 人免疫细胞培养的适宜温度一般为37°C，这与人体的生理温度相同。
在这个温度下，细胞内的酶促反应能够正常进行，细胞的代谢活动处于最佳状态。
3. 气体环境- 细胞培养需要特定的气体环境，通常为5% CO₂、95%空气的混合气体。
CO₂的作用主要是维持培养基的pH值，因为CO₂会与培养基中的缓冲体系发生反应，使pH值稳定在7.2 - 7.4之间，这一pH范围适合大多数人免疫细胞的生长。
4. 湿度- 细胞培养箱内的湿度一般保持在95%左右，以防止培养基的蒸发过快，避免细胞因渗透压的改变而受到损伤。
二、不同类型人免疫细胞的特殊培养条件1. T淋巴细胞- 除了基本的培养条件外，T淋巴细胞的激活和增殖往往需要特定的刺激因子。
例如，植物血凝素（PHA）或抗CD3/CD28抗体可以刺激T淋巴细胞的活化和增殖。
- 在某些研究中，为了维持T淋巴细胞的特定功能状态，可能会添加白细胞介素 - 2（IL - 2），IL - 2是一种重要的细胞因子，能够促进T淋巴细胞的生长、分化和存活。
2. B淋巴细胞- B淋巴细胞的培养可能需要添加特定的细胞因子，如白细胞介素 - 4（IL - 4）和白细胞介素 - 5（IL - 5），这些细胞因子有助于B淋巴细胞的增殖、分化和抗体分泌。
- 在研究B淋巴细胞的抗体产生功能时，可能需要与其他细胞（如树突状细胞或T淋巴细胞）共培养，以模拟体内的免疫应答环境。
细胞培养设施和基本条件
细胞培养设施和基本条件1、试验室设计: 细胞培育是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必需保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响.细胞培育室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁、空气清爽,干燥和无烟尘.细胞培育工作包括:工作液配制、无菌操作(采样)、温育、无菌处理,细胞和用品贮存等.细胞培育室的设计实施原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培育于一室,而洗刷消毒在另一室.2、常用设施及设备:(1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式、直流式和外流式三大类.(2)无菌操作间:一般由更衣间、缓部间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化碳培育箱、离心机、倒置显微镜等.缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等.(3)操作间:一般培育箱、离心机、水浴锅、定时钟、一般天平及日常分析处理物品.(4)洗刷消毒间:烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等.(5)分析间:显微镜、计算机及打印机等.3、培育器皿:细胞培育以玻璃器皿为主,常预备最需是使用最的三倍.器皿应选择透亮度好、无毒、中性硬度玻璃制品.常用的玻璃器皿有下面几种.(1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培育液、血清等液体,常以500ml、250ml、100ml生理盐水瓶或血浆瓶代替.(2)培育瓶:依据培育细胞种类要求不同培育瓶的形态各异,用于细胞传代培育的细胞要求瓶壁厚簿匀称,便于细胞贴壁生长和观看,瓶口要大小全都,口径一般不小于1cm,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml等几种.用于外周血培育的常用10ml一般圆瓶.两种培育瓶均要求选用优质玻璃制成.(3)培育皿:用于开放式培育及其它用途.分直径30mm、60mm、120mm等几种.(4)吸管:常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管.其改良后管上部有球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体.常用1ml和10ml两种.短吸管也叫滴管,分弯头和直头两种.(5)离心管:离心管是细胞培育中使用最广泛的器皿,依据用途不同形态各样,常用于细胞培育的离心管有大腹式尖底离心管和一般尖底离心管两类.前者分别为50ml、30ml、15ml;后者则多为10ml和5ml.(6)其它:如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等.。
3.细胞培养的基本条件-07资料
1）无菌室
◆
为无菌操作而设计的空间，包括操作间和缓冲间。
◆
操作间又可分为细胞室和感染室
缓冲间能保护无菌间的无菌环境，可兼有更换无 菌衣帽和进行一些简单操作（如放孵育箱、离心 等）的功能。
◆
◆
整个面积约10m2，通入经滤过的无菌空气，与周 围实验室比较应保持正压，常备紫外灯，室内其 他陈设尽量减少。
常用的消化液： 胰蛋白酶 依地酸二钠（disodium edetate,EDTA-2Na） 胶原酶
（1）胰蛋白酶
◆
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽
健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨 架，从而使细胞分离。
◆
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定
限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无 Ca2+ 、 Mg2+ 的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 ％ 。用滤器过滤除菌。
◆二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁
殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于
维持培养基的PH值。
◆大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范
围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸 性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞 生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8 时最适。
3）抗菌素溶液：
素的影响
具体工作： 器皿洗刷 孵育 细胞传代
试剂和培养液的配 制
制备细胞
细胞的冻存、复苏和运 输
无菌观念
◆必须树立无菌观念，坚持一贯的无菌操作，进
行无菌处理。
◆实验室应分为无菌室、准备室和洗刷消毒室，
除洗刷消毒室须分隔开外，无菌室和准备室可 在同一房间内，但需划分出不同功能区，即无 菌操作区和培养、观察区。
细胞培养基本条件
细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。
血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。
因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。
1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质：氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
细胞培养与细胞系的建立
细胞培养与细胞系的建立细胞培养是生命科学研究中必不可少的技术手段之一，它可以通过控制和维持细胞外环境，使细胞在体外生长和繁殖。
由于细胞培养技术可以在较短时间内得到大量的同种细胞，使得生物学和医学等领域的实验变得更加容易和方便。
而细胞系则是指由同一种细胞建立起来的一个细胞群体，是细胞生物学、分子生物学、药理学等领域里必不可少的研究对象。
一、细胞培养骨干技术1. 细胞培养的基本条件：细胞种类、培养基、培养条件（温度、CO2浓度、湿度、通气等）2. 细胞划分：原代细胞、细胞系、细胞株3. 细胞分离方法：酶消化、机械分离、胶质滤纸过滤、胶层分离、绒毛分离等4. 细胞凋亡与细胞健康状况监测：细胞膜容器渗透检测、Trypan蓝染色法、荧光染色等二、细胞系建立的过程1. 细胞培养条件的筛选：种类、培养基和培养条件2. 结合基因检测识别细胞：统一接种方法、培养期间生长速度的观察3. 细胞系的测定：细胞形态、DNA指纹技术、生物学/化学标记技术以及微镜下的观察三、细胞系的应用1. 细胞系的作用和意义：为生命科学研究提供常见、熟悉和稳定的实验平台2. 细胞系在生物学、分子科学、临床医学、肿瘤学、流行病学和毒理学等领域的应用3. 建立细胞系的意义：有效解决生命科学研究的问题，为人类健康提供保障细胞培养和细胞系建立是细胞生物学及其它相关工作的基础。
虽然细胞培养技术在不同领域的使用有着不同的需求和要求，但这种技术对生命科学的推进和人类健康的提高产生了极深的影响。
我们相信，随着科研工作的不断深化和发展，细胞培养和细胞系建立的技术也会不断地得到完善和发展，为人类的身体健康作出更大的贡献。
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细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基就是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养与促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长与繁殖的生存环境。
2、优质血清目前,大多数合成培养基都需要添加血清。
血清就是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境与培养环境就是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物与有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡。
因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境气体就是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气与二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基与天然培养基(目前使用的培养基绝大部分就是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基与液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便。
1、合成培养基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质:氨基酸氨基酸就是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺就是细胞合成核酸与蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。
因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但就是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物碳水化合物就是细胞生长主要能量来源,其中有的就是合成蛋白质与核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠与醋酸等。
无机盐培养液中无机盐的主要功能就是帮助细胞维持渗透压平衡。
此外,通过提供钠,钾与钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能。
培养液的渗透压就是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。
标准培养液的渗透压在此范围内波动。
特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别就是溶于强酸或强碱中的物质。
向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。
缓冲系统大多数细胞所需pH 在 7、2 - 7、4。
但就是,细胞培养最适pH 值随培养的细胞种类不同而不同。
成纤维细胞喜欢较高pH (7、4 - 7、7), 而传代转化细胞系则需要偏酸pH (7、0 - 7、4)。
由于多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2 体系进行缓冲,因此,气相中的CO2 浓度应与培养液中碳酸氢钠浓度相平衡。
如果气相或培养箱空气中CO2 浓度设定在5％,培养液中NaHCO3 的加入量为1、97g/L;如果CO2 浓度维持在10％,培养液中NaHCO3 的加入量为3、95g/L。
细胞培养瓶盖不应拧得太紧,以保证气体交换。
HEPES 就是一种非离子缓冲液,在pH 7、2 - 7、4 范围内具有较好的缓冲能力,但就是非常昂贵,在高浓度时对一些细胞可能有毒。
HEPES 缓冲液可与低水平的碳酸钠(0、34g/L)共用,以抵消因额外加入HEPES 引起的渗透压增加。
在这种培养条件下,细胞培养瓶的盖子应拧紧,以防止培养液中所需的少量碳酸盐散入空气中。
大多数培养液中含有酚红作为pH 指示剂,酸性培养液呈橙黄色,碱性培养液呈深红色。
维生素在细胞培养中,尽管血清就是维生素重要来源, 但就是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长。
其它成分在一些较为复杂的培养液中还包括其它一些成分。
如在杂交瘤技术中常用的DMEM 培养液,使用时还需要补加丙酮酸钠与2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol,2-Me)。
2-Me 对细胞生长有很重要的作用。
有人认为它相当于胎牛血清,有直接刺激细胞增殖作用。
2-Me的活性部分就是硫氢基,其中一个重要作用就是使血清中含硫的化合物还原成谷胱甘肽,能诱导细胞的增殖,为非特异性的激活作用。
同时避免过氧化物对培养细胞的损害。
另一个重要作用就是促进分裂原的反应与DNA 合成,增加植物凝集素(PHA)对淋巴细胞的转化作用,已广泛应用于杂交瘤技术,另外,也开始用于一些难以培养的细胞。
2-Me 就是一种小分子还原剂,极易氧化。
分子量为78、13,纯的2-Me 就是一种无色有刺激味的液体,比重为1、110-1、120(Do20),常用终浓度为5×10-5M。
常配制成0、1M 的储存液,用时每升培养液加0、5ml。
液体培养基保存:液体培养基应于4℃冰箱避光保存,实验前放入37℃预热。
未加血清液体培养基有效期为12 个月。
液体培养基中的L-谷氨酰胺会随着储存时间的延长而慢慢分解。
如果细胞生长不良,可以再添加适量L-谷氨酰胺。
干粉培养基保存:4℃冰箱避光保存,有效期36 个月。
血清细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清就是最常用的血清,分为胎牛血清与新生小牛血清。
胎牛血清就是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵。
新生小牛血清就是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。
如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种。
血清的质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长,而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同,尤其就是对克隆细胞的生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。
因此,在购买大量血清之前,必须对血清支持细胞生长能力进行检测,然后再大量购买质量好的同一批号的血清,并注意以下几点: (1)需要长期保存的血清必须储存于-20℃ –70℃ 低温冰箱中。
4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。
由于血清结冰时体积会增加约10％,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。
(2)一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。
如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。
(3)瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。
然后移入室温,待全部溶解后再分装。
在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。
切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
(4)热灭活就是指56℃, 30分钟加热已完全解冻的血清。
加热过程中須規則搖晃均勻。
此热处理的目的就是使血清中的补体成分(complement)灭活。
除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量。
补体参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞与血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞与巨噬细胞发生化学趋化与活化。
(5)切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。
(6)血清中的沉淀物絮状物:主要就是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量。
可用离心3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理。
显微镜下“小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。
有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染。
一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。
细胞培养环境1、实验室设计细胞培养就是一种无菌操作技术,要求工作环境与条件必须保证无微生物污染与不受其它有害因素的影响。
细胞培养室与设计原则就是防止微生物污染与有害因素影响,要求工作环境清洁、空气清新,干燥与无烟尘。
细胞培养室的设计原则一般就是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作与封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。
2、常用设施及设备(1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式、直流式与外流式三大类。
(2)无菌操作间:一般由更衣间、缓冲间与操作间三部分组成。
操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。
缓冲间可放置电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。
(3)操作间:普通培养箱、离心机、水浴锅、定时钟、普通天平及日常分析处理物(4)洗刷消毒间:烤箱、消毒锅、蒸馏水处理器及酸缸等。
(5)分析间:显微镜、计算机及打印机等。
3、培养器皿常用细胞培养器皿有培养瓶、培养板、培养皿等。
常准备量就是使用量的三倍。
器皿应选择透明度好、无毒、利于细胞粘附与生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。
常用的器皿有下面几种。
(1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液、血清等液体,常用规格有500ml、250ml、100ml 等几种。
(2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长与观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于1cm,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等几种。
(3)培养皿:用于开放式培养及其它用途。
分直径30mm、60mm、120mm 等几种。
(4)吸管:常用的有长吸管与短吸管两类,长吸管也称刻度吸管。
其改良后管上部有球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体。
常用1ml 与10ml 两种。
短吸管也叫滴管,分弯头与直头两种。
(5)离心管:离心管就是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管与普通尖底离心管两类。
前者分别为50ml、30ml、15ml;后者则多为10ml 与5ml。
(6)其它:如三角烧瓶、烧杯、量筒、漏斗、注射器等。
4、细胞培养温度维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度。
不同种类的细胞对培养温度要求也不同。
人体细胞培养的标准温度为36、5℃±0、5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1 小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1 小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1 小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1 小时,细胞全部死亡。
相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25－35℃时,细胞仍能生存与生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长。