免疫组化的原理和步骤

免疫组织化学的概念:

免疫组化就是利用抗原与特异性结合的原理,通过化学反应使标记的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。

免疫组化实验所用的有哪些？

免疫组化实验中常用的抗体为单抗体与多抗体。单抗体就是一个B淋巴细胞分泌的抗体,应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

免疫组化实验所用的组织与细胞标本有哪些？

实验所用主要为组织标本与细胞标本两大类,前者包括石蜡切片(病理大片与组织芯片)与冰冻切片,后者包括组织印片、细胞爬片与细胞涂片。

其中石蜡切片就是制作组织标本最常用、最基本的方法,对于组织形态保存好,且能作连续切片,有利于各种染色对照观察;还能长期存档,供回顾性研究;石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响,但可进行抗原修复,就是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？

石蜡切片标本均用甲醛固定,使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时,需要先进行抗原修复或暴露,即将固定时分子之间所形成的交联破坏,而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法,高压加热法,酶消化法,水煮加热法等,常用的修复液就是pH6、0的0、01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

免疫组化常用的染色方法有哪些？

根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲与组织化学法,后者就是以一种物质对

某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。

抗体交叉反应的原因:

指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面:

1、抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子,它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子,必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。

2、共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。

3、决定簇相似,两种不同的抗原决定簇,如果结构大致相同,由于空间构象关系,某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。

免疫细胞化学技术

一、免疫细胞化学技术的概述

*免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC)

-就是利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要就是多肽与蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为～。

(一) 对抗原与抗体的要求

*具有特异性高与亲与力强的抗体就是实验成功的首要条件。

-对抗体的要求:纯度高、比活性强;

*高度特异性抗体的获得,取决于抗原的纯度。

-对抗原的要求:纯度高,免疫原性强,稳定无变化。

(二) 抗原(antigen, Ag)

*抗原的概念:凡就是在机体内引起体液免疫与(或)细胞免疫反应的物质,称为抗原。抗原具有两个方面的特性:

-免疫原性:引起机体产生抗体与(或)致敏淋细胞的特性;

-免疫反应性:抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。

*根据抗原就是否显示免疫原性分为:

-完全抗原:分子量较大,一般在10kDa以上,并具有较复杂的化学组成。

*免疫原性最强的就是蛋白质抗原,多糖次之;脂类与核酸必需与蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。

-半抗原:又称为不完全抗原,分子量较小。例如:某些短肽、多糖、类脂与药物等。

*半抗原必需与载体结合,才能获得免疫原性。

载体:通常就是具有高度免疫原性的大分子物质,具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。

-常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin,OVA)等。

-用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合5～25个分子的小肽。

(三)抗体(antibody, Ab)

1、抗体的概念:

*机体受到抗原刺激后,由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白,被称为抗体。

-抗体主要存在于血清内;

-抗体都就是免疫球蛋白,但免疫球蛋白并不一定都就是抗体。

-免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种,既IgG、IgD、IgE、IgA、IgM。

2、免疫组化实验中常用的抗体:单克隆抗体与多克隆抗体。

*单克隆抗体:就是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体,就是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。

-特异性强、抗体产量高。

*多克隆抗体:就是将纯化后的抗原直接免疫动物后,从动物血中所获得的免疫血清,就是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。

-特异性低,会产生抗体的交叉反应。

-多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片,可减少假阴性染色机会。

-抗原与抗体的结合,要求量保持一定比例,当抗原或抗体过量时,就是不能聚合成大颗粒。

3、抗体的制备——多克隆抗体的制备

*动物的选择

*佐剂(adjuvant)

*免疫方法

*免疫剂量

*抗体效价的测定

*放血或定期抽血

(1) 动物的选择

选择什么动物来免疫取决于:

*所需抗血清的量

-小鼠只能提供1、0～1、5ml的血液,而山羊能提供几升。

*能供免疫用的抗原量

-小鼠50 g足够,而山羊需要几毫克。

(1) 动物的选择(续)

*动物的品系:免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。

-例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。

-常用的动物有兔、羊、马、猪等,以兔(新西兰兔,年轻,健壮,体重在2.5kg左右,雄性)为最常用。

(2) 佐剂(adjuvant)

*一般可溶性抗原注射后,迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间,且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中,常将抗原与佐剂一起注射。

*最常用的佐剂就是弗氏佐剂,又分为:

-弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)

-弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)

弗氏不完全佐剂

(Freund's incomplete adjuvant, FIA)

*就是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成,比例为1:1、2:1、3:1或5:1,可根据需要而定,通常2:1。

*使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合,使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。

弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant, FCA)

*在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为2～20mg/ml),即成为FCA。

*免疫动物时,将弗氏佐剂与抗原按体积1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。

-一般首次注射时用完全佐剂乳化,第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。

佐剂与抗原乳化的方法

*研磨法:适于制备大量的佐剂抗原

-先将不完全佐剂加热,取1、73ml放人无菌玻璃研钵内;缓缓滴入0、23ml活卡介苗,边滴边按同一方向研磨,使菌体完全分散。

-按同样方法滴人抗原,每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢,待抗原全部加人后,应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。

*缺点:研钵壁上粘附大量乳剂,抗原损失较大,对微量或难得抗原不宜采用。

佐剂与抗原乳化的方法(续)