植物组织培养—第一章

三、无菌操作：
1. 接种室以及工作台灭菌：紫外灯30分钟，用时一 定要关闭它。
2. 工作台消毒：70%乙醇，用小型喷壶消毒或棉球 擦拭。
3. 点燃酒精灯，开启灭菌器,对使用器械进行烧烤 灭菌。器械冷却后方可使用。
第三节 培养基的配置
一、培养基成分
（ culture medium：维持离体细胞生存和生长的溶液）
细菌过滤器
二Leabharlann Baidu无菌操作室
作用： 进行植物材料分离接种的重要场所，需长时间的无菌操 作，对组织培养成功起关键作用。
试验设施： 超净工作台 紫外灯 固定式和移动式载物台 消毒器、广口瓶、酒精灯、酒精棉、机械支架 手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等
超净工作台 (a laminar flow hood)
工作原理:
利用鼓风机驱动空气 遁过高效过滤器除去 空气中的尘埃颗粒， 使空气得到净化。 净化空气徐徐通过工 作台面，使工作台内 构成无菌环境。
三、培养室
作用： 进行材料的培养的场所。 其大小、规模可根据工作性质设定。以充分利用空间和 节能为原则。
设备： 可调控光、温、湿度等设备。 还有固定式培养架、转床、摇床。 适用于器官（芽、茎、花药等）、愈伤组织、细胞和原 生质体的固体培养和液体培养。
自动双重纯水蒸馏器
灭菌室： ①高压蒸气灭菌装置：如立式、卧式和手提式灭菌器。
作用：培养基、器械、棉塞、无菌纸等灭菌消毒
USING THE AUTOCLAVE TO STERILIZE MEDIA, GLASSWARE OR OTHER LAB UTENSILS
高压灭菌设备
② 细菌过滤器：用于液体培养基灭菌装置。
3. 熏蒸灭菌： 利用药物熏蒸以达到灭菌的目的。用甲醛内加入高锰酸钾、 百菌清、硫磺熏蒸。用3%来苏尔溶液或1%漂白粉水溶液， 或0.2%过氧乙酸溶液喷洒、拖擦地板。培养室、接种室灭 菌.
4. 过滤灭菌： 使溶液通过夹有微孔滤膜的漏斗，滤膜孔径需选用0.3～ 0.45μm。在无菌环境下，用真空泵抽滤，其滤液为无菌。 液体培养（不耐高温活性物质）
饱和的重铬酸钾洗液：43克重铬酸钾溶于1000毫升蒸馏水中（饱和溶液）。
按1：1体积比将浓硫酸缓慢地倒入饱和重铬酸钾水溶液中。
流程：
（12h）
水洗 → 晾干 → 重铬酸钾洗液 → 自来水冲净 、蒸馏水洗两次 → 干燥
2、洗涤剂：洗衣粉、洗液
3、超声波洗净器：小型玻璃器皿，顽固性污渍。超声波除污。 （要加水）
实验室设计
一、准备室
作用：材料、培养器械的清洗、培养基准备、灭菌等 的准备工作。 普通化学实验室：仪器及设备、化学药品。 纯水仪、冰箱、移液枪、过滤灭菌器、电炉、微波炉、 磁力搅拌器、低速台式离心机、电脑等 。 作用：配制培养基。 洗涤室：清洗、贮存器皿设施、鼓风干燥箱等。 作用：玻璃器皿、用具和培养材料的洗涤。
5. 药剂灭菌： 用70～75%酒精、0.1～0.2%升汞、10%的次氯酸钠、新洁 尔灭、Clorox等药剂灭菌的方法。培养材料灭菌。
6. 烧灼灭菌： 用酒精灯烧灼达到灭菌的目的。接种器具灭菌。
7. 射线灭菌： 用紫外线照射的方法灭菌。照射时间一般为15～30min。 接种时应关闭紫外灯。室内灭菌。
铁常以FeSO4和乙二胺四乙酸钠(Na2-EDTA)的螯合物 存在于培养基中。
2、 有机化合物（organic compounds)
① 有机碳源：即糖类。 作用： 维持培养基的合适渗透压对初生细胞和原生质体的完整性有 十分重要作用。另外，糖类也是合成有机物的碳源。
1、无机盐(inorganic elements)——大量元素和微量元素
大量元素
① N：用量最多。常用的有硝态氮和铵态氮，KNO3、NH4NO3 植物组织
从培养基中吸收氮后形成蛋白质。
② P：在植物组织培养在的细胞增殖分化大量需要。主要 从NaH2PO4、 KH2PO4供应。磷参与核酸、能量代谢。
主要有： 1、无机盐(inorganic elements)：包括大量元素（N，P， K，Ca、S、Mg），微量元素（Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、 Cl、Co、I）。 2、 有机化合物（organic compounds) ：碳源（糖类）， 维生素类，有机含氮化合物。 3、植物生长调节物质：生长素，细胞分裂素，赤霉素， 脱落酸等。 4、 附加物类：琼脂，活性炭，椰乳，硝酸银等。
培养细胞或组织的各种器皿
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四、细胞学实验室：
作用：细胞学和组织学观察。
需备有高倍显微镜、体视显微镜、倒置显微镜、各种相机、 恒温箱、切片机、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻 片等。
五、温室： 作用：培育组织与细胞培养出来的材料，组培苗的移栽锻炼。
第二节 基本操作
一、洗涤方法
1、重铬酸钾洗液：
③ K：直接影响培养物中酶的活性。主要由KCl、KNO3或 KH2PO4供应。
④ Ca、S、Mg： CaCl2、Ca(NO3)2作为Ca来源，MgSO4作为S 和Mg的来源。
微量元素 主要包括Fe、Mn、Zn、B、Mo、Cu、Cl、Co、I等。 植物对这些元素需要量甚微，稍多会发生毒害。
Fe是用量较多的一种微量元素，对组织中叶绿素的 合成和延伸生长起重要作用。
第一章 实验室与基本操作
第一节 实验室及其基本设备
• 实验室的大小取决于工作的目的和规模： 1. 以工厂化生产为目的，实验室规模太小，
则会限制生产影响效率。 2.在设计组织培养实验室时，应按组织培养
程序来设计避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。 • 植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做 到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同 时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。
新的玻璃器皿：0.1﹪HCl浸泡12小时，洗衣粉、自来水洗、蒸馏水冲。 污染的玻璃器皿：要先高压灭菌后，然后再刷洗。要避免交叉污染。
二、灭菌方法：
1. 干热灭菌： 利用鼓风干燥箱（烘箱）进行烘烤灭菌的方法。箱内温度 控制在150℃，120min。玻璃器皿.
2. 湿热灭菌： 利用高压蒸汽灭菌的方法。一般温度为121℃，压力0.1MPa， 消毒15～20min。培养基灭菌.