一种HE4磁微粒化学发光检测方法的建立

多个器官组 织 中 呈 阳 性 表 达，随 着 对 其 功 能 的 细 化 研究，ＨＥ４蛋白还在胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤患者存 在高度表达［３８］，成为卵巢癌、肺癌、胰腺癌等恶性肿 瘤标志物，人附睾蛋白 ４有重要的临床应用价值。 由于进口试 剂 的 成 本 较 高，而 国 产 试 剂 质 量 良 莠 不 齐，本实验根据双抗体夹心法原理，利用抗体标记吖 啶酯技术、抗体标记 ＦＩＴＣ技术、抗 ＦＩＴＣ抗体偶联磁 微粒技术，开 发 吖 啶 酯 标 记 平 台 的 磁 微 粒 化 学 发 光
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０１９．０８．０３１ 收稿日期：２０１９０６２４；修回日期：２０１９０７１０ 作者简介：刘志敏（１９８６—），女，硕士研究生，北京北方生物技术研究所有限公司中级研发人员。主要研究方向：全自动管式
化学发光试剂盒开发。Ｔｅｌ：１３１２６６２３７１５；Ｅｍａｉｌ：２９４８０６５２０＠ｑｑ．ｃｏｍ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｄｅｖｅｌｏｐａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆｈｕｍａｎｅｐｉｄｉｄｙｍａｌｐｒｏｔｅｉｎ４ （ＨＥ４）．ＭｅｔｈｏｄｓＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｎｔｉｂｏｄｙｌａｂｅｌｉｎｇ，ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｏｔｈｅｒｍｅｔｈｏｄｓ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙｖａｌｉｄａｔｉｎｇｔｈｅｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｃｋｉｎｇｉｔｓｓｔａｂｉｌｉｔｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｍｅｔｈｏｄ ｈａｄａｎｉｎｔｒａｂａｔｃｈｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆ２．６％ ｔｏ３．０％，ａｎｉｎｔｅｒｂａｔｃｈｐｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆ３．２％ ｔｏ３．５％，ａｍｉｎｉｍｕｍ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｌｉｍｉｔｏｆ１９ｐｍｏｌ／Ｌ，ａｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｏｆ２５１５００ｐｍｏｌ／Ｌ，ａｌｉｎｅａｒｅｖａｌｕａｔｉｏｎｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒｏｆ ０．９９９８，ａｎｄｔｈｅａｄｄｅｄｒｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅｏｆａｃｃｕｒａｃｙｔｅｓｔｗａｓ１０７％，ＨＯＯＫ ４００００ｐｍｏｌ／Ｌ．Ｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆ１１５ｃｌｉｎｉｃａｌｃａｓｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＲｏｃｈｅｗａｓ０．９９．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｔ２８℃，ｔｈｅｒｅａｇｅｎｔａｔ３７℃ ａｎｄ７ｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ１０％，ｗｉｔｈａｇｏｏｄｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ． ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅＨＥ４ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｈａｓｂｅｅｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｓｔｕｄｙ，ａｎｄｉｔｓｂａｓｉｃ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ｃｌｉｎｉｃａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｒｅｓｕｌｔｓｃａｎｍｅｅｔｔｈｅｍａｒｋｅｔｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｉｓｓｔａｂｌｅａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｆｅａｓｉｂｌｅ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＥ４； Ａｕｔｏｍａｔｉｃｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ； Ｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈｍｅｔｈｏｄ
较；筛选试剂工作浓度确定最适反应浓度，筛选样本 量、反应时间、稀释液确定最佳反应条件。 ２．６ 分析程序 ①加样：分别取 ２５μＬ检测样 本（校准品和血清）、５０μＬ吖啶酯ＨＥ４，５０μＬＦＩＴＣ ＨＥ４于样本杯内混匀；②孵育：３７℃孵育 １０ｍｉｎ；③加 磁微粒并孵育：加入 ５０μＬ磁微粒，３７℃孵育 ５ｍｉｎ； ④洗涤：北方所自制清洗液清洗 ３次；⑤ 发光并读 值：加入预激发液和激发液各 １００μＬ，读取相对发光 强度 ＲＬＵ，由全自动仪器自带的分析软件按四参数 方式对校准曲线进行拟合，自动计算出样本中 ＨＥ４ 的浓度，使用 Ｅｘｃｅｌ２０１０对测试结果的偏差、相关性 等进行偏差分析。 ２．７ 方法学评价 批间和批内精密度和最低 检测 限：配 制 ＨＥ４高、低 值 质 控 （约 ６００ｐｍｏｌ／Ｌ与 １５０ｐｍｏｌ／Ｌ），零浓度校准品，５０ｐｍｏｌ／Ｌ校准品。 两 个 浓 度 质 控 品，低 值 质 控 品 （ＱｃＬ）和 高 值 质 控品（ＱｃＨ）使用同一批次的试剂重复检测 １０次，计 算 １０次测量结果的平均值（ｘ）和标准差（ｓ），根据公 式：变异系数（ＣＶ％）＝ｓ／ｘ×１００％，即批内精密度； 低值质控品（ＱｃＬ）和高值质控品（ＱｃＨ）使用三个批 次的试剂重复检测 ３０次，得到 ３０次测量值，按照公 式计算结果为批间精密度。 平行测定 ２０孔零浓度校准品的相对发光强度， 计算相对发光强度的平均值（ｘ）和标准差（ｓ），根据 零浓度校准品与 ５０ｐｍｏｌ／Ｌ校准品之间的浓度发光 值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将 ｘ＋２ｓ所 对应的发光 值 代 入 上 述 方 程，求 出 对 应 的 浓 度 值 为 最低检测限。 线性范围、性能评估、准确性：使用抗原配制不 同浓度的校准品，确定校准品最宽检测线性范围；准 确测定高值样本（１５００ｐｍｏｌ／Ｌ左右），将其按一定比 例稀释为 ５种浓度，检测结果和理论浓度比较，计算 Ｙ＝ａＸ＋ｂ，要求 ａ值在 １±０．０５范围内，线性相关系 数 ｒ≥０．９７５，截距 ｂ＜待测浓度的 ５％；将高值样本 （１５００ｐｍｏｌ／Ｌ左右）加入到血清基质中，所加入的高 值样本体积不超过总体积的 １０％，根据公式计算回 收率，测定结果回收率应在 ８５％ ～１１５％之间。 Ｒ＝Ｃ×（Ｖ０ ＋Ｖ）－Ｃ０ ×Ｖ０ ×１００％
标记免疫分析与临床 ２０１９年 ８月第 ２６卷第 ８期
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产品，满足 国 内 市 场 和 临 床 需 求。 本 研 究 将 通 过 筛 选抗体最佳 配 对 组 合，找 到 测 试 血 清 样 本 相 关 性 较 好的抗体配 对；通 过 对 吖 啶 酯 标 记 技 术 的 优 化 与 改 进以及试剂 浓 度 筛 选，找 到 合 适 的 抗 体 与 标 记 物 的 投料 比，提 高 抗 体 被 标 记 的 利 用 率、标 记 产 物 的 纯 度，更准确的了解后续参与免疫反应的抗体分子数， 延迟 ＨＯＯＫ效应出现并防止假性样本的出现；通过 对试剂稀释 液 进 行 分 析，得 到 单 个 试 剂 组 分 在 产 品 中的作用，细化筛选产品每个组分的稀释液，选择零 点信号值低 的 稀 释 液，确 定 试 剂 最 佳 反 应 环 境 及 稳 定的试剂保 存 条 件，保 证 试 剂 质 量 从 而 建 立 一 种 测 定血清人附睾蛋白 ４（ＨＥ４）的磁微粒化学发光定量 免疫试剂检测的方法。
Baidu Nhomakorabea
ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａＭｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨＥ４ ＭａｇｎｅｔｉｃＰａｒｔｉｃｌｅｓｂｙＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ
ＬＩＵ Ｚｈｉｍｉｎ，ＺＥＮＧ Ｌｉｎｇ，ＨＯＵ Ｌｉｌｉ，ＬＩＹｕｂｉｎｇ
（Ｒ＆ｄＣｅｎｔｅｒ，ＢｅｉｊｉｎｇＮｏｒｔｈＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｏ．，Ｌｔｄ．Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００７６，Ｃｈｉｎａ）
近几年，人附睾蛋白 ４（ｈｕｍａｎｅｐｉｄｉｄｙｍａｌｐｒｏｔｅｉｎ ４，ＨＥ４）作为新型肿瘤标志物被广泛研究，它是相对 分子量较小 的 分 泌 性 糖 蛋 白，因 有 两 个 乳 酸 蛋 白 重 链也被称为 ＷＦＤＣ２，自 １９９１年 ＫＩＲＣＨＨＯＦＦ从人的 附睾远端上 皮 细 胞 中 发 现 以 来，尚 未 发 现 其 全 部 生 理功能。在卵 巢 癌、子 宫 内 膜 癌 等 妇 科 恶 性 肿 瘤 患 者的血 清 中 检 测 到 分 泌 型 人 附 睾 蛋 白 ４的 高 表 达［１２］，人附睾蛋白 ４还在唾液腺、气管上皮、附睾等
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ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ ＣｌｉｎＭｅｄ，Ａｕｇ．２０１９，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．８
一种 ＨＥ４磁微粒化学发光检测方法的建立
刘志敏，曾 玲，侯莉莉，李玉彬
（北京北方生物技术研究所有限公司研发中心，北京 １０００７６）
摘要：目的 建立一种测定血清人附睾蛋白 ４（ＨＥ４）的磁微粒化学发光定量免疫试剂检测的方法。方法 根据双抗体夹 心法原理、标记抗体、优化筛选等建立检测方法，通过验证性能、临床评价、跟踪稳定性等方法验证有效性。结果 该方法 批内精密度为 ２．６％ ～３．０％，批间精密度 ３．２％ ～３．５％，最低检测限为 １９ｐｍｏｌ／Ｌ，线性范围 ２５～１５００ｐｍｏｌ／Ｌ，线性评估相 关系数 ｒ为 ０．９９９８，准确性试验的回收率为 １０７％，ＨＯＯＫ４００００ｐｍｏｌ／Ｌ；临床 １１５例样本结果与罗氏结果相关系数 ｒ为 ０．９９，无异常值；试剂在 ３７℃ ７ｄ降幅在 １０％范围内。结论 成功建立了 ＨＥ４磁微粒检测方法，其基本性能、临床评价与 稳定性结果均能满足市场快速检测的要求，稳定可靠。 关键词：ＨＥ４； 自动化学发光； 双抗体夹心法
材料和方法
１ 材料 吖啶酯、ＦＩＴＣ为美国 Ｓｉｇｍａ公司的产品；磁微粒 ＭＳ３００为日本 ＪＳＲ公司的产品；４个抗体及抗原由武 汉奥科生物公司提供；常规化学试剂为国药购买；全 自动发光仪 购 买 于 重 庆 科 斯 迈 公 司 和 罗 氏 公 司；其 他耗材为国 产 厂 商 提 供；临 床 样 本 由 北 京 中 同 蓝 博 临床检验所提供。 ２ 方法 ２．１ 吖啶酯标记抗 ＨＥ４抗体 将一定比例的 吖啶酯 加 入 抗 ＨＥ４抗 体 溶 液 中，混 匀，避 光 孵 育。 终止反应后，将得到的产物换液至磷酸盐缓冲液 ｐＨ ６．８中，加入 ０．１％的防腐剂和 １％ＢＳＡ，－２０℃ 避光 保存。 ２．２ ＦＩＴＣ标记抗 ＨＥ４抗体 将 ０．５ｍｇ／ｍＬ的 ＦＩＴＣ与抗 ＨＥ４抗体除盐后避光过夜反应，终止并除 盐后保存至磷酸盐缓冲液 ｐＨ７．４中，加入 ０．１％的 防腐剂和 １％ＢＳＡ，－２０℃避光保存。 ２．３ 磁微粒偶联抗 ＦＩＴＣ抗体 将磁微粒与抗 ＦＩＴＣ抗体（按照 １００：１的比例）混合反应加入适当 的 ＥＤＣ活化，使用封闭剂封闭后加入磁珠保存液， 于 ４℃保存。 ２．４ 校准品配制 使用 ０．０５ｍｏｌ／Ｌｔｒｉｓ稀释液 稀释 ＨＥ４抗原，配制校准品浓度分别为 ０、５０、１００、 ３００、７５０、１５００ｐｍｏｌ／Ｌ，校 准 品 溯 源 至 对 比 罗 氏 试 剂 盒一级校准品，偏差控制在 ±１０％以内。 ２．５ 抗体配对与优化筛选 ４个抗体，均使用 吖啶酯进行标记，同时使用 ＦＩＴＣ进行标记，配对共 有 １２个组合，测试容易产生假阳的临床样本 ４例， 判断阴阳 性 并 与 罗 氏 试 测 试 该 样 本 进 行 相 关 性 比
Ｖ×ＣＳ 式中：Ｒ：回收率；Ｖ：加入 Ａ的体积；Ｖ０：加入 Ｂ 的体积；Ｃ：Ａ加入 Ｂ后的测定浓度；Ｃ０：Ｂ的检测浓 度；ＣＳ：Ａ的检测浓度。 ＨＯＯＫ效 应：使 用 抗 原 配 制 高 浓 度 梯 度 样 本 并 检测。
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ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ ＣｌｉｎＭｅｄ，Ａｕｇ．２０１９，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．８
临床评价：收集有值样本 １１５份，使用罗氏 ＨＥ４ 试剂与北方所 ＨＥ４试剂分别检测，通过计算相关系 数判断北方所试剂与罗氏试剂的相关性。 稳 定 性 测 试：筛 选 各 组 分 的 的 稀 释 液 并 将 全 组 分试剂放置 ３７℃烘箱中，放置 ７ｄ，与放置 ２～８℃（７ 天）全套试剂，－２０℃ 冻存 （７天）全套试剂同时测 试，其中 －２０℃冻存（７天）全套试剂可认为对照试 剂，评价 ３７℃试剂与 ２～８℃试剂发光强度 ＲＬＵ偏 差，精密度和线性相关系数 ｒ。