4人工种子与植物脱毒教程

§4.2 植物脱毒
◆ 植物脱毒
● 为什么？（植物病毒及其危害）
● 怎么脱毒（方法）？
● 如何鉴定？
1、植物病毒及其危害
烟草花叶病毒TMV
植物病毒的危害
当病毒侵染寄主植物后，感病植物代谢异常，
使植物的叶片黄化，褪绿，皱缩，卷曲；
使植株矮化，坏死； 使果实减少或畸形。
2、植物脱毒方法
方法：
物理方法：高温、低温处理法，X射线、紫外线使病毒钝化 化学方法：抑制剂，如放线菌酮、8-鸟嘌呤、三氯唑核苷等
（3）人工胚乳配制
• 人工胚乳(Artifical endosperm)主要包括无机盐
、碳水化合物、蛋白质等（如MS培养基成分），为胚 胎发育提供营养保证。
• 由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以还
要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。
（4） 包埋
• 方法主要有以下两种： • 干燥法：这是比较早的一种包埋方法。将胚状体
植物组织培养的应用：
第四章
人工种子与植物脱毒
体细胞胚再生途径的应用：
§4.1 人工种子
• 1. 人工种子（seed）定义：是指将植物离体培养中产生
的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种子 的颗粒。又称合成种子(Synthetic seed)或体细胞种子(Somatic seed)。
（2）嫁接法：木本植物病毒不通过汁液传播。将 脱毒植物茎尖微嫁接在指示植物砧木上，观察有 无出现病毒感染症状。
3.3 电镜检测 (Electron Microscopy)
电镜下检测病毒形态、 大小及结构 制片技术包括： 超薄切片技术
负染技术 免疫电镜技术
杆状烟草花叶病毒TMV
3.4 抗血清检测法
2.3 生物脱毒法
2.3.4 珠心胚培养法
利用种子珠心胚可以培养具有母侏遗传特性的无病毒 苗木，因为珠心胚是不带病毒的。
2.3.5 花药培养法
通过花药培养获得单倍体植株，再利用秋水仙素处理 使染色体加倍，从而获得无病毒苗木，why？ 马铃薯脱毒试管苗
3 脱毒植物效果鉴定
再生植株后，一般应在18个月以内进行病 毒检测，因为病毒在植物体内的潜伏期一般 在6～12个月。
（2）人工种皮制作
• 理想的人工种皮(Artifical seed coat)应该具有保护
胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气性、抗 污染、适合运输等特点。
• 最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有一定毒性、
易溶解于水等不足。目前采用海藻酸盐（钠、钙）较 多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒 性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，例如： 水性营养成分易流失、表面易结团等。因此，开发理 想的人工种皮材料仍是一个重要课题。
（5）人工种子的储存
一般将人工种子贮藏在4—7℃低温、相对湿度小 于67%的条件下。实际上随贮藏时间的延长,人工 种子的萌发率会显著下降。
4. 人工种子制作存在的问题
• （1）人工种皮性能不尽人意。 • （2）还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳。 （3）胚状体储藏阶段的休眠控制； （4）如何保证长期储藏而又不影响萌发率； （5）制作流程较繁琐、成本高。 （6）许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚。
病毒蛋白抗原免疫动物，获得含特异结合抗体 的血清，再与脱毒植物是否发生血清反应检测：
酶联免疫吸附测定 (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)
3.5 分子检测技术
利用已知病毒DNA序列设计引物或探针，检测脱毒植物
核酸杂交技术 (Southern blot)
• 在结构上从外向里包括三部分：
（1）人工种皮外层，保护胚状体 中的水分免于丧失和防止外部力 量冲击；（2）人工胚乳，含有 必需的营养成分和某些植物激素； （3）胚状体或芽。
2.人工种子的优点
• （1）便于运输和储藏（相对于试管苗）。 • （2）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通
过加入植物激素、有益微生物或抗病、抗虫成分 ，使人工种子优越于天然种子。
生物方法：茎尖培养、微体嫁接，愈伤组织、珠心胚、花药培养
2.1 物理方法
2.1.1 高温处理（热疗法）
原理：在35-50℃热处理下，病毒活性被有效钝化，失去 浸染能力，但宿主细胞伤害较小。此方法主要对一些圆 形、线形病毒有效，而对杆状病毒无效，而且处理时间 较长，易使植物受到损伤。
常用2种处理方式： 温汤处理： 50℃热水处理几分钟到几小时，适用于离体 材料和休眠器官。 热风处理：以35-40℃热风处理植物几十分钟至数天。
tissue
virus particles found here
2.3 生物脱毒法
2.3.2 微体嫁接法
将0.14~1.0mm茎尖嫁接在无病毒实生苗砧木上。 无病毒砧木来源：常用热处理法获得 适用情况：无法或特难组织培养成植株的植物，如木本 果树。
2.3.3 愈伤组织诱导法
愈伤组织细胞分裂快，病毒复制能力减退或丧失，因此 也可获得无病毒苗木。 由无病毒细胞产生的愈伤组织可以获得无病毒苗木；
2.1.2 低温处理：低温能使病毒活力下降，失去感染力。
2.2 化学脱毒法
一些化学试剂可以抑制病毒DNA复制和繁殖。
包括：
放线菌酮、三氯唑核苷、 8-鸟嘌呤、孔雀绿等 但化学试剂可能对植物也有一定毒害作用，所以 应用广泛。
2.3 生物脱毒法
2.3.1 茎尖培养法
原理：幼嫩的茎尖(0.2~0.5mm)、根尖等生长点是不含 病毒的，因为： ①茎尖分生速度快于病毒增殖和传播速度； ②茎尖分生组织未分化，无维管组织，而病毒在植物体 内主要是通过维管组织或胞间连丝来传播的。 virus-free 该法优点： 脱毒效果好、周期短、效率高。 不足：微茎尖难剥离，组培难度大。 提示：茎尖培养与高温处理相结合脱毒效果更好。
PCR扩增技术
谢 谢！
• （3）可以固定杂种优势，保存珍贵稀有植物品种。 • （4）利于快速繁殖，生产效率高（尤其是没有种子
和种子昂贵的植物）。
3. 人工种子制作
• （1）胚状体同步发育
控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的关键环节之一，主要方法如下：
• 抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如5-氨基尿嘧 啶），去除抑制剂后细胞可以同步发育(S期始）。 • 低温法：低温处理使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，使分裂 指数提高，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化(G1期始）。 • 渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定 的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。 • 通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通 过在培养基中通入3-5%乙烯+CO2或氮气控制细胞同步分裂。 • 分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开 来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。
置于23℃、70%左右相对湿度、黑暗条件下逐渐 干燥，然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。
• 水凝胶法：这是目前比较常用的一种方法。用海
藻酸钠等水溶性凝胶与Ca2+进行离子交换后凝固 的特点包埋单个胚状体或芽。种子硬度由凝胶浓 度与络合时间控制。
海藻酸钠包埋示意图
包埋液（人工胚乳）制备： 2%-4%的海藻酸钠+营养 物、生长因子等如MS。 将成熟的体细胞胚胎与包 被液相混合，然后将其滴 入（只允许一个通过）适 当浓度的氯化钙溶液中， 经过络合作用（生成海藻 酸钙）的造形过程，在2030分钟内形成内含细胞胚、 有一定硬度的雏形人工种 子。
病毒检测的方法：
● 3.1 直接检测法 观察脱毒后植株茎、叶等器官生长情况，有无 病毒引起的症状。
3.2 指示植物鉴定（ indicator plant test）
指示植物： 对病毒反应敏感、症状明显的植物。如 烟草、马铃薯、葡萄、柑桔等。 方法： （1）摩擦接种法：用脱毒植物叶片中汁液与金刚 砂或石英沙摩擦指示植物叶片，冲冼 培养数天， 观察有无出现病毒感染症状。