乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法

乳酸菌活菌数量检测方法--菌落计数法

本方法适用于乳酸菌制剂及配合饲料中有效活菌数和杂菌率的测定。

按照国家标准GB/T 14699.1进行抽样，获得样品200g，分装于两个无菌、干燥的玻璃瓶中，贴上标签，注明产品名称、批号、取样日期等信息。一瓶供检验用，一瓶密封保，以备复查。

一、测定原理：

乳酸肠球菌用肠球菌琼脂培养基，杂菌用营养琼脂培养基；培养后利用平板菌落计数法进行计数。

二、培养基与缓冲液配方：

（1）营养琼脂培养基，每L

蛋白胨 10.0g 牛肉膏 3.0g 氯化钠 5.0g 琼脂 18.0g 水稀释至

1000ml PH 7.0~7.4

（2）肠球菌琼脂培养基，每L

蛋白胨 20.0g蔗糖 5.0g 葡萄糖 5.0g 乳糖 5.0g 酵母膏 5.0g

氯化钠 4.0g 乙酸钠 1.5gVc 0.5g 琼脂 17.0g 水稀释至1000ml

PH 6.5~7.0

（3）PH6.8磷酸缓冲液配制方法

取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀即得。

三、样品处理：

（1）乳酸菌纯品制剂样品

测定乳酸菌纯品制剂时，取样量为1g，溶解到100ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为100:1。

（2）配合饲料样品

测定饲料样品时，取样量为25g，溶解到225ml缓冲液中，缓冲液与样品的比例为10:1。

四、有效活菌数、杂菌数的测定：

（1）本方法采用平板菌落计数法

（2）操作方法：

1．取磁力搅拌棒装入500ml三角瓶中，再量225ml PH6.8的磷酸缓冲液一并装入三角瓶中灭菌备用。纯品制剂量取缓冲液100ml。

2．取25g饲料样品放入三角瓶中，在磁力搅拌器中震荡混匀5min后，再放到摇床上37℃，150转/分，充分震荡45min，混匀成1：10稀释液。纯品制剂样品量为1g，混匀成1：100稀释液。

3．在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul缓冲液的离心管内，并在液体中反复吹打5次，在漩涡振荡器上震荡30s混匀（注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀）。

4．按上述操作顺序，做10倍比稀释，纯品制剂推荐稀释到10-8，配合饲料推荐稀释到10-4。

5．选择4个适宜稀释度，吸取该稀释度的液体10 ul滴于灭菌平皿上，每个稀释度做3个平行。（注意分三点滴，便于液体充分散开）

6．置于烛缸中37℃培养36 h后，计数菌落。

（3）计算公式：

1、有效活菌数：

a.计算出平皿同一稀释度3个平行组的菌落平均数。

b.产品活细胞数＝菌落平均数×稀释倍数×10

2、杂菌率①：杂菌率（%）= [杂菌数÷（有效活菌数+杂菌数）]×100%

注①只对乳酸菌纯品制剂进行评定，对配合饲料不采用这个指标。