提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展

提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展
肖生科1,2　王磊2　陈毓荃1
(1西北农林科技大学生命科学学院,杨凌　712100;2中国农业科学院生物技术研究所,北京　100081)
摘　要:　巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的糖基化修饰、折叠、加工、外分泌及表达量等方面有明显的优势。

外源基因在该系统中表达时,由于受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,一些外源蛋白的表达也存在着表达不够稳定、表达量较低,甚至不表达的情况。

对影响巴斯德毕赤酵母表达的各种可能因素进行了分析,结合具体实践经验,就如何提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的问题进行了综述。

关键词:　巴斯德毕赤酵母　酵母表达系统　基因表达
The Study on Improving Expression Levels of H eterologous
G ene in Pichia pastoris
Xiao Shengke1,2　Wang Lei2　Chen Yuquan1
(1College of L if e Sciences,Northwest Sci2Tech U niversity of A gricult ure and Forest ry,Yangli ng　712100;
2Biotechnology Research Instit ute,Chi nese Academy of A gricult ural Sciences,Beiji ng　100081)
Abstract:　As a eukaryote expression system,Pichia pastoris has been widely used in genetic engineering,which has many merits in the gene expression,protein process and secretion.The gene expression is influenced by a number of factors,such as the structure of gene,secretion signal peptides,methanol concentration,induction phase,temperature, PH,and promoter etc.These factors make some heterologous genes express unstably or express a little.This article ana2 lyzes these factors and reviews how to im prove expression levels of heterologous genes in Pichia pastoris.
K ey words:　Pichia pastoris　Y east expression system　G ene expression
动物、植物、微生物作为生物反应器为外源基因的表达提供了理想的环境,是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容,也是生命科学研究领域的热点之一[1]。

大肠杆菌被誉为是外源蛋白质表达的“工厂”,其具有易操作性,生长速度快,培养条件简单等优势。

但是,大肠杆菌是低等的原核生物,不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所———内质网和高尔基体。

虽然许多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达,但有些表达的产物缺乏天然的生物活性或结构。

哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统虽然能够表达结构复杂的真核细胞蛋白,但操作复杂,表达水平低,产业化生产造价昂贵,不易普遍推广使用[2]。

酵母是单细胞低等真核生物,它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性,同时又具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统,还能分泌外源蛋白到培养液中,利于纯化[3]。

1　利用巴斯德毕赤酵母表达外源基因的优缺点
酿酒酵母(S.cerevisiae)是首先被用来作为外源基因表达的宿主菌,然而其表达重组蛋白有一定的局限性,使其产业化应用受到了限制[1]。

出芽酵母(Kl uyverom yces lactis)表达外源基因时与酿酒酵母相似,但表达量偏低,也不利于推广应用和规模化生产。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是甲基营养型酵母,其乙醇氧化酶启动子(AOX)已被分离、克隆,这种酵母已经发展成为外源蛋白表达非常成功的宿主[4]。

人们已在巴斯德毕赤酵母中已成功表达了多种外源蛋白,如IGF21和人血清蛋白已通过临
生物技术通报
・综述与专论・ B IO TECHNOL O G Y　BULL ETIN 2004年第2期
床试验;乙肝表面抗原在南非已作为小单元疫苗投放市场[4];人重组白细胞介素11(rhL211)[5]、人血管内皮生长因子受体Flt2l胞外区223loop[6]、血管生成抑制因子(K4K5)[7]、抗Ⅳ型胶原酶单链抗体[8]等医药用蛋白均成功表达。

与其他表达系统相比,巴斯德毕赤酵母有以下诸多方面的优点:①在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源,但不存在象细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题[9]。

②在缺少葡萄糖的情况下,巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一的碳源生长[10]。

表达实际上是利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子,从而启动乙醇氧化酶的表达,在有乙醇氧化酶存在的条件下进一步催化甲醇的代谢,进行重组蛋白质的表达。

③具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境,使生产的蛋白具有天然的高级结构及生物学活性。

④有两个基因编码乙醇氧化酶基因———A O X1、A O X2。

其中A O X1基因的表达主要受较高水平的甲醇诱导和调节。

巴斯德毕赤酵母既保持了酿酒酵母的优点,还能大幅度提高外源蛋白的产量[9]。

⑤许多在大肠杆菌中不能表达的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中得到了有效的表达,其方便的操作和低廉的成本使毕赤酵母表达系统极具市场潜力。

⑥表达分泌的蛋白质常被O2糖基化或N2糖基化,其中主要是在蛋白质氨基酸序列的Asn2X2SerΠThr位点处进行N2糖基化,以高甘露糖型的糖基化形式存在,寡糖链的长度一般为8～14个甘露糖残基[9]。

与酿酒酵母相比较,巴斯德毕赤酵母在表达蛋白质过程中是适度的糖基化修饰,使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白。

此外,如果是糖蛋白,还经高尔基复合体对糖链的进一步剪切,使表达蛋白的糖链不含α123甘露糖,避免了酿酒酵母中的免疫原性问题,使表达的糖蛋白更适于治疗用途[10]。

尽管巴斯德毕赤酵母在表达外源蛋白有以上优势,但是外源基因在表达过程中受基因内部的结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的p H值等诸多因素的影响,使外源蛋白的表达随环境条件的变化而不稳定,甚至一些蛋白的表达量会很低或不表达。

因此,通过对这些可能影响外源基因表达的各种因素进行系统的分析,得出提高外源蛋白表达量的可能途径就具有重要的理论和实践意义。

2　提高外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达量的途径
2.1　优化基因内部结构
外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达量高低首先受到外源基因的内部结构的影响,也是表达成败的首要因素。

可以通过以下几种途径优化基因内部结构以实现外源蛋白的表达。

①优化mRNA5′端非翻译区(5′U TR)的核苷酸序列和长度,mRNA的非翻译区对蛋白表达的影响主要表现在mRNA的翻译水平上。

A O X1mRNA的5′U TR 长114nt,富含A+U。

目的蛋白mRNA应尽可能具有与A O X1mRNA相近,最好是相同的5′U TR。

一般地,目的基因编码序列的第一个A TG应尽可能接近,最好处于A O X1A TG的位置[11]。

Sreekrishna等通过调整人血清白蛋白mRNA与AOX1mRNA的5′U TR相同后表达水平提高50倍以上[12]。

同时,一个适当长度的5′U TR可极大地促进mRNA有效地翻译。

②起始密码子旁侧序列改造:如果起始密码子周围容易形成RNA二级结构序列,将会阻止翻译的进行,通过RNA折叠分析可找到可能阻碍翻译正常起始的二级结构,然后利用替代密码子重新设计并调整翻译起始区及其旁侧序列,对基因进行改造[13]。

③A2T序列改造:目的基因的特性对表达的影响被认为是一种种属特异性的现象[14]。

有些基因内部富含A2T序列,可在转录的过程中提前终止而导致仅产生低水平或截短的mRNA[11],给基因的表达带来困难,因此在不改变翻译蛋白质密码子的条件下去掉A2T序列,除去mRNA中可能形成终止结构的区域,使目标蛋白得到表达。

④基因人工合成:在不改变氨基酸组成的前提下,将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子,可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。

在酵母中表达量较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子[15]。

在巴斯德毕赤酵母中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍[16]。

⑤氨基酸序列改造:蛋白质氨基酸序列中如果含有高度复杂的胱氨酸结
42
生物技术通报Biotechnology　Bulletin 2004年第2期
构基序,这种结构可能是影响合成效率的因素之一,因此可改变这部分的碱基,消除复杂的胱氨酸结构基序[17]。

2.2　分泌信号的改造
外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达分为胞外和胞内两种表达情况,表达的蛋白要分泌到胞外必须经过信号序列的引导[17]。

信号肽与目标蛋白相融合,从而在蛋白质加工折叠后引导其分泌到胞外。

最常用的信号肽是来源于酿酒酵母的A因子信号肽和巴斯德毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽,其中以A 因子信号肽最为成功,也是使用最广泛的信号肽,它能促进多种异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[4]。

但有时在表达一些蛋白的过程中,A因子信号肽用就不能引导外源蛋白分泌或不能有效地分泌到胞外,而使胞外目标蛋白的浓度极低,给后面的分析和检测带来不便。

因此,改造信号序列,引导目标蛋白高效的胞外分泌也可提高目的蛋白的表达量。

信号肽对不同的异源蛋白分泌效率会有很大的差异,有些外源蛋白甚至不能被A因子和酸性磷酸酶信号肽分泌,需要新的信号肽才能使外源蛋白分泌[18]。

有些信号肽的分泌效率还受胞内mRNA的积累水平、培养条件和诱导条件的影响[19]。

在A因子中间插入EEAEAEAEP K共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高2倍以上[10]。

有报道,利用菊粉酶的信号肽(ISP)序列来构建巴斯德毕赤酵母分泌载体并表达了β2葡聚糖酶,结果表明ISP信号肽序列在巴斯德毕赤酵母能够很好地引导重组蛋白分泌到细胞外,分泌效率不低于A因子信号肽[20]。

2.3　调整甲醇诱导的浓度和诱导时间
大多巴斯德毕赤酵母表达系统是利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子来进行外源蛋白表达的[17]。

甲醇的浓度直接影响细胞的生长和蛋白质的表达。

研究发现,不同的甲醇浓度导致不同的蛋白表达量。

有报道,酵母中外源蛋白在甲醇浓度为0.7%(VΠV)的条件下表达量较高,并且随甲醇的浓度的提高(<3%)能显著地提高蛋白的表达量[17]。

利用摇瓶诱导表达过程中甲醇容易挥发,浓度逐渐减少从而使蛋白的表达量下降,因此,诱导培养期间维持甲醇的浓度将直接关系到表达量多少。

此外,诱导时间也影响表达量的高低,在诱导期间,分别按24hr、36hr、48hr、72hr、96hr不同时间取样分析,发现外源蛋白随着时间的延长其表达量逐渐增加,但在72hr 表达量已接近最高,过多的诱导时间其表达量的提高并不显著。

2.4　选择合适的培养温度
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白适宜的温度为30℃,温度达到32℃时所有的蛋白表达都会停止[17]。

在酵母生长或高量表达时会释放出大量的热量,因此,整个发酵过程中进行温度的调节,热交换,加热、冷却装置等都是必不可少的。

另外,一些蛋白质对培养温度要求较高,必须在合适的温度条件下才能得到较好的表达。

如鲱鱼的抗冻蛋白在23℃时表达量最高并且减少了错误折叠的积累,在其他温度条件下则不表达或表达量极低[21]。

一般情况下,巴斯德毕赤酵母表达期间的温度不应高于30℃,但不排除特殊蛋白质的特殊表达条件。

2.5　选择高表达的启动子
巴斯德毕赤酵母表达最常用的启动子为乙醇氧化酶AOX1,AOX2启动子是甲醇诱导型启动子[17]。

如果外源蛋白不能表达或表达量过低,可以选择其他强启动子进行表达。

如P G AP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是一种组成型启动子[22]。

使用P G AP 在发酵时不需要甲醇诱导,不需更换碳源,工艺简单,而且产量更高,所以成为替代PAox1的最强有力的启动子[11]。

Doring等分别用p G APZ B和p PICZ B来生产兔肾肽载运蛋白(rPEPTZ)和小人肠肽转运蛋白(hp EPTZ),前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍,看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时P G AP比PAox1更理想[15]。

另外,PFLD1(依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶启动子)[23]是以甲醇或甲胺为单一碳源的诱导型启动子,也是一种高水平表达的启动子。

2.6　筛选高拷贝转化子
一般情况下,转化子所含的表达盒的拷贝数越高,其外源蛋白的表达水平也越高。

多拷贝整合有利于充分发挥表达潜力。

最近的研究显示,在1～8整合拷贝数范围内,乙肝表面抗原(HbsAg)表达量随基因剂量的增加而成比例升高[24]。

获得高拷贝转化子的方法有:(1)利用同尾酶向载体中多次插入
52
2004年第2期 肖生科等:提高外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达量的研究进展
首尾相连的表达盒,构建一个含多拷贝表达盒的载体[11]。

研究报道,获得最高含有8个乙肝表面抗原(HbsAg)表达盒重复序列的载体,将其整合入宿主菌株GS115基因组,同时去除A O X1基因,构建Muts型,可引起HBsAg的mRNA稳定增加,从而使HBsAg蛋白表达量增加[25];(2)使用一种包含巴斯德毕赤酵母的HIS4基因和细菌的卡那霉素抗性基因Tn903Kanr基因的载体。

细菌的卡那霉素抗性基因使巴斯德毕赤酵母菌能抗G418药物,抗性越强,拷贝数越高[26]。

(3)使用含细菌Shble基因的载体,它包含Zeocin抗性基因,可直接根据抗药性进行筛选。

理论上表达量会随基因拷贝数的增加而上升,但也有少数例外,即拷贝数增加对表达产生负效应[11]。

高拷贝低表达的原因可能在于mRNA翻译、蛋白折叠效率的低下,而对于一些分泌效率低的蛋白,过高表达会对分泌途径产生负反馈抑制。

2.7　阻止外源蛋白降解
外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的过程中同时伴随着一定量的蛋白酶的表达。

因此,表达的外源蛋白就存在被降解的可能,在一定程度上影响蛋白质的表达量,同时,还给目的蛋白的纯化带来难度。

为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采用以下几种方法:①改造巴斯德毕赤酵母表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定[15]。

②培养基中添加蛋白胨或酪蛋白水解物等物质作为蛋白酶的底物[27]。

③由于巴斯德毕赤酵母能忍耐较宽的p H范围(p H3.0～7.0),因此可调节溶液p H值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解[15]。

研究表明:某些可溶性的膜结合蛋白在p H5.0的条件下表达量最高。

此外,在培养基中加入少量的TritonX2114或蛋白酶抑制剂可提高表达量[9]。

④突变外源蛋白基因的个别位点,改变其蛋白序列中蛋白酶的作用部位使其免受蛋白酶的破坏[27]。

⑤降低甲醇诱导表达时的培养温度[15],Mei M等通过将诱导表达时的温度由30℃降至25℃,半乳糖氧化酶表达量提高4倍[28]。

2.8　选择合适的酵母菌生长密度
一般来讲,在诱导培养过程中,酵母菌生长的密度越高,菌体的生物量越大,则总的表达量亦应该越高。

但是,密度越高培养基中氧和营养供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性都会对菌体产生影响[15]。

因此,高密度并不一定意味着高表达。

此外,培养基的组成及生长状况也与表达量有关,如在表达mEGF时,在BMM Y培养基中单拷贝转化子表达量为20μgΠL,而在不含蛋白胨和酵母提取物的基本培养基中表达量少于1μgΠL[29]。

综上所述,巴斯德毕赤酵母表达系统是一个较好的被广泛使用的真核表达系统,具有许多优点,但是由于表达的外源蛋白质的复杂性和多样性,以及外源基因与酵母基因组重组的情况及表达调控的途径还不十分清楚的情况下,使得特定外源基因的高效分泌表达不可能一蹴而就。

随着对巴斯德毕赤酵母研究和认识的进一步深入,相信人们会利用该表达系统高效生产出人类所需要的大多数活性蛋白,在基因工程产品产业化、商品化进程中,发挥越来越大的作用。

参考文献
1　马兴元,谭建华,朱平,等.中国兽医学报,2003,23(1):98～101. 2　Heckney RC.TrendsBiotech,1994,12(11):456～463.
3　BruelC,Cha K,ReevesPJ,et al.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97
(7):.3004～3009.
4　华慧,周思翔,王正荣.外国外医学生物医学工程分册,2003.26
(3):112～117.
5　朱剑昆,许志详,黄伟达,等.中国医学科学院学报,2001,23(2): 127～131.
6　马骊,王小宁,张智清,等.分子与细胞免疫学,2001,2:61～65.
7　官孝群,王跃祥,吴良成,等.生物工程学报,2001,17(2):126～130.
8　阎锡蕴,汤健,刁爱坡.微生物学通报,2001,28(1):48～52.
9　G eoff,PLin,Cereghino,et al.Current Opinionin Biotechnology, 2002,13:329～332.
10　熊爱生,彭日荷,李贤,等.生物化学与生物物理学报,2003,35
(2):154～160.
11　李洪钊,李亮助,孙强明,等.微生物学报,2003,43(2):288～292.
12　Sreekrishna K,Barr KA,HoardSA,et al.Y east,1990,6(special is2 sue):S4471.
13　Sreekrishna K,BrankampRG,Kropp KE,et al.G ene,1997,190:55～62.
14　ClareJJ,ScorerCA,BuckholzRG,et al.Methods MolBiol,1998, 103:2091.
(下转第30页)
化:与野生型对照相比,在生长了35天之后,表达V Hb的转基因烟草植株平均干重增加80%～100%,叶绿素和尼古丁分别增加30%～40%和34%。

转基因烟草中叶绿素水平增加,可能是由于V Hb增加了A TP和氧的供应量,它们均参与叶绿素生物合成中的几步反应。

因为已知增加叶绿素的含量会导致增加植物的生长,所以在表达V Hb的转基因植株中增加的叶绿素含量至少会部分促进转基因植株的生长。

另外,由于V Hb与氧亲和力适度并位于整个胞质溶胶中,从而可以使细胞中有较稳定的氧浓度。

除此之外,V Hb还可能有其他一些功能,例如:清除氧自由基、作为一种末端氧化酶、还原过氧化物酶以及抑制种子中不饱和脂肪酸的氧化等,这些可能也有助于增加转基因植株的生长。

综上所述,v gb基因在各种细胞中表达,不同程度地促进了细胞的生长,并提高了它们利用能量的效率,如大肠杆菌中的蛋白质合成量明显增加,而碳源的消耗和产酸量没有提高。

vgb基因在多种原核与真核生物中表达效果良好,表明它在溶氧为限制条件的生物反应器中,尤其在工业化的大规模、高密度微生物和动、植物细胞培养方面具有巨大的应用前景。

参考文献
1　Hardison RC.Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:5675～5679.
2　Tyree B,Webster DA.J Biol Chem,1978,253:6988～6991.
3　Wakabayashi S,Matsubara H,Webster DA.Nature,1986,322: 481～483.4　Dikshit K L,et al.Nucleic Acids Research,1990,18:4149～4155. 5　Khosla C,Bailey J E.J Molec Biol,1989,210:79～89.
6　Dikshit K L,Webster DA.G ene,1988,70:377～386.
7　Khosla C,Bailey J E.Nature,1988,331:633～635.
8　Bailey J E,Sburlati A,Hatzimanikatis V,et al Biotechnol Bioeng, 1996,52:109～121.
9　K aur R,Pathania R,Sharma V,et al.Applied and Environmental Microbiology,2002,68(1):152～160.
10　Khosla C,Bailey J E.Mol G ene G enet,1988,214:158～161. 11　Khosla C,Bailey J E.J Bacteriol,1989,171:5995～6004.
12　Verderber E,et al.J Bacterology,1997,179(14):4583～4590. 13　Hart RA,K allio PT,Bailey J E.Appl and Environ Microbiol, 1994,60(7):2431～2437.
14　Boeman S,Webster DA.J G en Appl Microbiol,1982,28:35～
43.
15　Tsai PS,K allio PT,Bailey J E.Biotechnol Prog,1995,11:288～293.
16　Magnolo SK,Leenutaphong DL,DeModena JA,et al.BioΠTechn2 ology,1991,9:473～476.
17　吴奕,等.生物工程学报,1996,12(2):177～182.
18　章银梅,等.遗传学报,2000,27(2):183～188.
19　Chen R,Bailey J E.Biotechnol Prog,1994,10:360～364.
20　Khosravi M,Webster DA,Stark BC.Plasmid,1990,24:190～194.
21　Liu SC,Webster DA,Stark BC,Appl Microbiol Biotechnol,1995, 44:419～424.
22　Tsai PS,Hatzimanikatis V,Bailey J E.Biotechnol Bioeng,1996, 49:139～150.
23　K allio PT,Bailey J E.Biotechnol Prog,1996,12:31～39.
24　Chen W,Hughes DE,Bailey J E.Biotechol Prog,1994,10:308～313.
25　Brewin NJ,Flavell RB.Nature Biotechnol,1997,15:222～223.
(上接第26页)
15　聂东宋,梁宋平,李敏.吉首大学学报(自然科学版),2001,22
(3):112～116.
16　姚斌,张春义.中国科学(C辑),1998,28(3):237～243.
17　.
18　Brierley RA.MethodsMolBiol,1998,103:149～1771.
19　ScorerCA,ClareJJ,McCombieWR,et al.R Biotechnology,1994, 12:181～184.
20　韦宇拓,甘凤琼,苏华波,等.广西农业生物科学,2001,22(1):40～44.
21　LiA,XiongF,LinQ,d’AnjouM,DaugulisAJ,Y angDSC,HewCL:.
Protein Expr Purif,2001,21:438～445.
22　Waterham H R,Digan M E,K outz PJ,et al.G ene,1997,186
:37～44.
23　Shen S,Sultar G,Jeffries T W,et al.G ene,1998,216:93～102.
24　VassilevaA,ChughDA,SwaminathanS,et al.Protein Expr Purif, 2001,21(1):71～80.
25　ShenS,Sultar G,JeffriesTW,et al.G ene,1998,216:93～102.
26　MenendezJ,G aniaB,Hidalgo Y.Biothchniques,2000,29(5):1094～1099.
27　齐连权,陈薇,来大志,等.中国生物工程杂志,2002,22(6):45～
47.
28　Mei M,WhittakeR,JameS W,et al.Protein Expression and Purifi2 cation,2000,20:105～111.
29　Clare JJ,Romanos MA.G ene,1991,105:205～212.。