青蒿素基因

微生物发酵工程案例教学
疟疾在年发病率不超过十万分之三的中国可能并不为 人们关注，但是在非洲 平均每30 就有一名 非洲， 30秒 一名儿童死于 人们关注，但是在非洲，平均每30秒就有一名儿童死于 疟疾。 疟疾。 世界范围内， 世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在 亿到5 之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在一 3亿到5亿之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在一 到三百万之间, 这其中大部分为儿童。 到三百万之间, 这其中大部分为儿童。
微生物发酵工程案例教学
研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内 合成的： 合成的：
焦磷酸法呢 酯（FPP） ） Amorphadiene （合成青蒿酸及
青蒿素的最直接 的前体原料 ）
青蒿酸
青蒿素
微生物发酵工程案例教学
由于酵母也可以合成FPP， 由于酵母也可以合成FPP，所以我们所需要做的只是将 FPP FPP到Amorphadiene再到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母 再到青蒿酸 FPP到Amorphadiene再到青蒿酸这两个过程克隆进入酵母 细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控， 细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控， 使之能正常并且大量合成青蒿酸。 使之能正常并且大量合成青蒿酸。
微生物发酵工程案例教学
其次，利用一个 其次， methioninerepressible启动 methioninerepressible启动 PMET3) 子 (PMET3) ，通过对编码鲨 稀合酶（ 稀合酶（固醇生物合成途径 FPP合成后第一步 合成后第一步） 中FPP合成后第一步）的ERG9 基因进行负调控，可将amor 基因进行负调控，可将amor 进行负调控 phadiene的合成量再增加两 phadiene的合成量再增加两 菌株EPY225 EPY225）； 倍（菌株EPY225）；
微生物发酵工程案例教学
第五组： 第五组：利用基因工程酵母生产抗疟疾药物
前体--青蒿酸 前体--青蒿酸 --
微生物发酵工程案例教学
选用这篇文章的原因： 选用这篇文章的原因：
符合微生物发酵的主题，且综合分子生物学、 符合微生物发酵的主题，且综合分子生物学、微生物 微生物发酵的主题 学、细胞生物学等学科 大部分为我们所学的知识：生化中的甲羟戊酸途径； 大部分为我们所学的知识：生化中的甲羟戊酸途径； 甲羟戊酸途径 分子生物学实验手段等等 实验思路简单明了， 实验思路简单明了，充分体现对知识的灵活运用 简单明了 实验结果影响深刻，将会对疟疾治疗带来一场革命 实验结果影响深刻，将会对疟疾治疗带来一场革命 疟疾治疗带来一场
微生物发酵工程案例教学
疟原虫的生命周期很复杂。 疟原虫的生命周期很复杂。通 蚊子叮咬进入宿主体内後首 过蚊子叮咬进入宿主体内後首 先侵入肝脏细胞 肝脏细胞， 先侵入肝脏细胞，再由肝脏进 入血液感染红血球，在红血球 入血液感染红血球， 红血球 无性繁殖扩增之後 扩增之後， 内无性繁殖扩增之後，受外部 环境因素的影响， 环境因素的影响，它们可以继 续感染新的红血球， 续感染新的红血球，也可能形 配子体（gametocyte）， ），当 成配子体（gametocyte），当 蚊子吸取受感染的血液後，雄、 蚊子吸取受感染的血液後， 雌配子体进入蚊子胃 蚊子胃内发育成 雌配子体进入蚊子胃内发育成 有性生殖， 配子并进行有性生殖 配子并进行有性生殖，合子最 终在胃壁下形成卵囊 终在胃壁下形成卵囊 oocyte）。 ）。卵囊中疟原虫进 （oocyte）。卵囊中疟原虫进 行无性繁殖，最终形成孢子体 行无性繁殖，最终形成孢子体 sporozoite）进入蚊子唾液 （sporozoite）进入蚊子唾液 腺，准备感染新的脊椎动物宿 主。
微生物发酵工程案例教学
然后，尽管upc2然后，尽管upc2-1, 一个 upc2 可以加强UPC２（啤酒酵母 可以加强UPC２ UPC 中调节固醇合成的一个的通 用转录因子） 用转录因子）活性的半显性 突变体等位基因， 突变体等位基因，在已有菌 EPY208背景下 背景下过表达 株 EPY208背景下过表达 （菌株EPY210）对 菌株EPY210） EPY210 amorphadiene合成的提高起 amorphadiene合成的提高起 的作用并不显著， 的作用并不显著，但结合对 ERG9基因的负调控 基因的负调控， ERG9基因的负调控，其过表 达可将amorphadiene amorphadiene的合成 达可将amorphadiene的合成 量提高到105mg/L（菌株 量提高到105mg/L（ 105mg/L EPY213）； EPY213）；
微生物发酵工程案例教学
一、疟疾
俗称“打摆子” 俗称“打摆子”，是一 种由疟原虫 疟原虫属， 疟原虫（ 种由疟原虫（疟原虫属， Plasmodium spp.是 是 一类单细胞真核生物 单细胞真核生物， 一类单细胞真核生物， 属于细胞内寄生虫） 属于细胞内寄生虫）造 成的，通过疟蚊 疟蚊传播的 成的，通过疟蚊传播的 全球性急性寄生虫传染 病。
微生物发酵工程案例教学
二、青蒿素
由于传播疟疾的恶性疟原虫（ falciparum） 由于传播疟疾的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum） 具有复杂的生命周期 因而很难根除这种疾病， 复杂的生命周期， 具有复杂的生命周期，因而很难根除这种疾病，治疗是 唯一的选择。 抗药疟原虫突变系 唯一的选择。而抗药疟原虫突变系Plasmodium falciparum2,3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。 的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。 而青蒿素，一种由我国学者在20世纪70年代初从 青蒿素，一种由我国学者在20世纪70年代初从 我国学者 世纪70 Artemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来 菊科植物，俗称青蒿） 的倍半萜内酯环内过氧化物（ 15倍半萜），通过释放 倍半萜）， 的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），通过释放 高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是 高剂量的自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。 自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫 目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的 药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望” 药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望”。
微生物发酵工程案例教学
人工合成青蒿素由于其工艺复杂、 人工合成青蒿素由于其工艺复杂、 毒副作用大、成本高而不能投入 毒副作用大、 生产。 生产。世界上青蒿素药物的生产 主要依靠我国 我国从野生和栽培青蒿 主要依靠我国从野生和栽培青蒿 中直接提取。 中直接提取。但是青蒿中青蒿素 的含量很低(0.1% (0.1%w/w),且 的含量很低(0.1%-1% w/w),且 受地域性种植影响较大。目前使 受地域性种植影响较大。 用青蒿素进行治疗每个疗程的费 用是８美元到１５美元， １５美元 用是８美元到１５美元，对于受 疟疾危害最深的非洲和南美地区 的贫困患者来说过于昂贵 昂贵。 的贫困患者来说过于昂贵。
微生物发酵工程案例教学
三、基因工程合成青蒿酸
基于这些因素， 基于这些因素，科学家们开始尝试利用基因工程手 段通过微生物去合成这种物质。 段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为 青蒿素计划” 由美国加利福尼亚大学伯克利分校 加利福尼亚大学伯克利分校的 “青蒿素计划”，由美国加利福尼亚大学伯克利分校的 主持，并且起初就获得“ 生化工程师Jay Keasling 主持，并且起初就获得“比 梅琳达盖茨基金会” 万美元的资助。 尔-梅琳达盖茨基金会”4260 万美元的资助。 等宣布， 2006 年，Keasling 等宣布，通过合成生物学技 术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造， 术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以 产生高水平的青蒿酸 青蒿酸（ acid）——青蒿素 产生高水平的青蒿酸（artemisinic acid）——青蒿素 的一种直接的前体。 的一种直接的前体。 该成果发表于2006 2006年 13日英国 自然》杂志上， 日英国《 该成果发表于2006年4月13日英国《自然》杂志上， 题为“ 题为“Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast ”
微生物发酵工程案例教学
首先，将一种截短的水溶性酶3 首先，将一种截短的水溶性酶3-羟 甲基-戊二酰辅酶A还原酶（ 基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（我 们所学生化书中为译为β 羟基们所学生化书中为译为β-羟基-β甲基-戊二酰辅酶A还原酶， 甲基-戊二酰辅酶A还原酶，简称 HMGCoA还原酶 又简称tHMGR 还原酶， tHMGR， HMGCoA还原酶，又简称tHMGR，是固 醇合成的限速酶）过表达， 醇合成的限速酶）过表达，可提高 amorphadiene的合成产量近五倍 amorphadiene的合成产量近五倍 EPY208）； （菌株 EPY208）；
微生物发酵工程案例教学
再次， 再次，在酵母染色体更 远处在转进一个tHMGR 远处在转进一个tHMGR 拷贝可以将将其合成量 再增加50%达到149mg/L 50%达到 再增加50%达到149mg/L （菌株 EPY 219） ； 219）
微生物发酵工程案例教学
最后，虽然编码FPP合酶的基因 最后，虽然编码FPP合酶的基因 FPP ERG20）过表达对amorphadiene amorphadiene合成 （ERG20）过表达对amorphadiene合成 总量（ EPY224） 总量（菌株 EPY224）的提高效果非常 细胞密度降低的情况下其合 但在细胞密度降低 小，但在细胞密度降低的情况下其合 成量却可增加10% 10%。 成量却可增加10%。将所有这些对基因 的修饰综合在菌株EPY224 EPY224上 的修饰综合在菌株EPY224上， amorphadiene的合成量已经达到了 amorphadiene的合成量已经达到了 153mg/L , 是之前所报道这种倍半萜 最大合成水平的几乎500 500倍 (烯)最大合成水平的几乎500倍。
微生物发酵工程案例教学
酵母与青蒿相比： 酵母与青蒿相比：
真核 糖酵解 甲羟戊酸途径
真核 糖酵解 甲羟戊酸途径
但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍， 但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍， 而且其培养条件容易控制，不受气候、 而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影 因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、 响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、 高效的。 高效的。
微生物发酵工程案例教学
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
而细胞中与amorphadiene 而细胞中与amorphadiene 的量最直接相关的就是 FPP的量 所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene 的量， amorphadiene的 FPP的量，所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的 能力，我们对FPP合成途径（甲羟戊酸合成途径） FPP合成途径 能力，我们对FPP合成途径（甲羟戊酸合成途径）进行了 总共5 的基因工程改造。 总共5次的基因工程改造。 几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控 FPP合成相关的基因的表达被正调控， 几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外 几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控 FPP转变成固醇的基因被负调控。 几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证 宿主菌株的遗传稳定性， 宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修 饰都是通过染色体融合 染色体融合进行的 具体过程如下： 饰都是通过染色体融合进行的 。具体过程如下：
微生物发酵工程案例教学
四 具 体 流 程
为了将流程图转 为现实， 为现实，我们对 酵母细胞进行了 总共8 总共8次的基因工 程改造。 程改造。
微生物发酵工程案例教学
第一步， 第一步，为了能让酵母 细胞合成Amorphadiene Amorphadiene， 细胞合成Amorphadiene，我 ADS基因插入由 们将ADS基因插入由GAL1 们将ADS基因插入由GAL1 启 动子控制转录的pRS425 pRS425质粒 动子控制转录的pRS425质粒 然后在酵母细胞中表达， 中，然后在酵母细胞中表达， 结果显示单独转入ADS ADS基因 结果显示单独转入ADS基因 的酵母只合成少量的 amorphadiene。 amorphadiene。如图中菌株 EPY201， EPY201，4.4mg/L 。