一株自养硝化细菌培养条件的优化

一株自养硝化细菌培养条件的优化

摘要：针对前期筛选的自养硝化杆菌（Nitrobacter）菌株y3-2，以实时荧光定量核酸扩增检测系统（qPCR）测定的菌液终浓度为指标，设计单因素试验和正交试验对其培养基和培养条件进行优化。结果表明，优化的硝化杆菌y3-2的培养基中CaCO3、Na2CO3、NaNO2浓度分别为0.5、1.0、0.5 g/L。最佳培养条件为培养温度28 ℃、pH 8.0、摇床转速200 r/min。优化后硝化杆菌y3-2的发酵周期由优化前的7 d缩短至4 d，菌液终浓度达到4.31×109 CFU/mL。

关键词：硝化杆菌（Nitrobacter）；培养基；培养条件；优化

氮素是水体污染源的主要成分之一，水体的脱氮技术已经成为人们关注与研究的热点[1]。与传统的物理化学脱氮工艺相比，生物脱氮具有成本低、效率高、无二次污染等优势。现今采用最多的生物脱氮工艺为硝化—反硝化工艺，其中的硝化工艺由硝化细菌（Nitrifying bacteria）完成[2]。硝化细菌分为自养型硝化细菌和异养型硝化细菌2类，异养型硝化细菌仅占很少一部分，自养型硝化细菌是生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群，其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率[3]。硝化过程通常由氨氧化细菌（Ammonia-oxidizing Bacteria，AOB）先将氨氮转化为亚硝酸盐，然后由亚硝酸氧化细菌（Nitrite-oxidizing Bacteria，NOB）将亚硝酸盐转化为硝酸盐[4]。与自养型AOB 一样，自养型NOB具有生长速度慢、自然条件下数量低等特点，这一方面使NOB 的研究较为困难，另一方面也制约了其工业化生产和应用。因此，研究加快NOB 生长速度的培养方法显得尤为重要[5，6]。本研究以一株亚硝酸氧化细菌y3-2[7]为出发菌株，对其培养基和培养条件进行了优化，并采用实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time quantitative PCR detecting system，qPCR）计数的方法对其菌液浓度进行计数，以期获得能快速培养硝化杆菌y3-2的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种试验用菌种硝化杆菌y3-2由农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室分离纯化保藏，经16 S rDNA鉴定为硝化杆菌属（Nitrobacter）细菌。

1.1.2 优化前培养基及培养条件优化前初始培养基：MgSO4·7H2O 0.12 g/L、NaH2PO4·2H2O 1.16 g/L、K2HPO4·3H2O 0.33 g/L、MnSO4·H2O 0.007 6 g/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 50 μg/L、无水NaCO3 0.5 g/L、NaNO2 1.0 g/L、pH 7.5，121 ℃、30 min灭菌。优化前的培养条件为250 mL三角瓶加入50 mL培养基，200 r/min、30 ℃恒温培养。

1.1.3 试剂亚硝酸盐和硝酸盐定性检测试剂[8]：Griess试剂、盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液、二苯胺—硫酸试剂，细菌基因组DNA提取试剂盒和Real Master

Mix（SYBR Green）试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，硝化杆菌qPCR 标准样品为农业微生物学国家重点实验室发酵工程分室自制。

1.2 方法

1.2.1 培养基的优化

1）单因素试验。设计单因素试验分别考察培养基中CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对试验菌株生长的影响。①CaCO3浓度。Na2CO3浓度1.5 g/L，NaNO2浓度0.5 g/L，CaCO3浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、5.0 g/L。②Na2CO3浓度。CaCO3浓度0.5 g/L，NaNO2浓度0.5 g/L，Na2CO3浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 g/L。③NaNO2浓度。CaCO3浓度0.5 g/L，Na2CO3浓度1.5 g/L，NaNO2浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L。每个单因素试验设置3个平行，每天定性检测NO2-、NO3-含量，观察NO3-生成情况，记录NO2-完全硝化所需时间，并对细菌进行计数。

2）正交试验。设置三因素三水平正交试验考察CaCO3、Na2CO3和NaNO2浓度对细菌生长的影响，每个试验设置2次重复。

1.2.2 培养条件的优化采用优化后的培养基培养菌株，设置单因素试验考察培养温度、pH和转速对菌株生长的影响。①温度。将种龄为48 h的新鲜菌液以5%的接种量接种到装有50 mL培养基的250 mL三角瓶中（后面摇瓶试验接种方法一致），分别在15、20、25、28、30、35 ℃下恒温培养，pH控制在7.0～7.5，转速设为200 r/min，记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数；选择适宜的温度范围进行正交试验。②pH。培养基pH控制为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培养温度为28 ℃，转速设为200 r/min。记录NO2-完全硝化所需时间及菌落数。

③转速。将活化后的菌种接种到三角瓶中，28 ℃恒温培养，pH 8.0，转速分别为50、100、150、200、250 r/min，记录NO2-完全硝化时间及最终菌落数。每个单因素试验设置3组平行。

1.2.3 分析方法亚硝酸盐定性检测使用Griess试剂法；硝酸盐定性检测使用二苯胺-硫酸试剂法[8]；菌液浓度定量分析：首先提取收集菌液的基因组DNA，然后使用Real-time PCR定量计数方法进行计数[9]，qPCR反应体系总体积为20 μL，含有Real Master Mix/20×SYBR solution 9 μL、FGPS872（5′-TTTTTTGAGATTTGCTAG-3′）1 μL（终浓度100 nmol/L）、FGPS1269（5′-CTAAAACTCAAAGGAATTGA-3′）1 μL（终浓度100 nmol/L），DNA模板1 μL，超纯水8 μL。Real-time PCR反应程序为：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性20 s，50 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，共循环40次；最后一步设置自动制作溶解曲线。通过计算机对样品PCR结果和标准样品PCR结果进行对比分析，计算出扩增基因片段的拷贝数，从而推算出样品中的菌体含量。

2 结果与分析

2.1 培养基的优化结果