VIG病毒诱导基因沉默技术
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Байду номын сангаас
PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿 素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光 漂白症状。 PDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。
VIGS应用的载体
DNA病毒(载体构建简便、无需体外转录、操作难度 低) →1998,基于双生病毒番茄金色花叶病毒TGMV的VIGS 体系成功建立(第一例DNA病毒载体) →2004,非洲木薯花叶病毒ACMV →2008,棉花皱叶病毒CLCrV →2010,水稻东格鲁杆状病毒RTBV(实现农杆菌介导 接种高效沉默水稻內源基因PDS，第1例能够通过农 杆菌介导接种水稻的VIGS载体)
病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得
• • • • • • • • 1.设计引物(保守序列，200bp) 2.构建载体(γ ) 3.体外转录 (准备质粒，线性化质粒) 4.体外涂抹 5.观察病毒表型(BSMV) （提取RNA,反转录成cDNA,检测基因表达水平） 6.观察表型
VIGS原理
dsRNA:双链RNA; Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ (RibonucleaseⅢ, RNase Ⅲ) 家族的成员; siRNA:小干扰RNA ; RISC:RNA诱导沉默复合体
VIGS应用的载体
利用植物病毒作为载体的优点:
• 病毒能吸附到完整的植物细胞并将它们的核酸导 入到细胞中 • 感染的植物细胞产生大量的病毒，因此重组病毒 载体可以高效表达转入的外源基因。 • 病毒感染可以蔓延整个植株 • 病毒感染快
VIGS应用寄主
• 寄主范围有限，针对不同的寄主植物往往需要开发 不同的病毒载体。 • 2002，大麦抑制PDS（大麦条纹花叶病毒BSMV，进 一步在小麦上应用） • →2006，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒BMV • →2006，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒BPMV） • →2010，大豆（改造后无需体外转录，增加沉默效 率）
VIGS应用的载体
RNA病毒(最早最多) →1995,首次基于烟草花叶病毒TMV载体构建 (携带八 氢番茄红素脱氢酶PDS侵染烟草，上位叶片褪绿白化) →1998,马铃薯X病毒PVX(沉默PDS诱发白化效应) → 2001,烟草脆裂病毒 TRV(因其具有病毒症状较轻、 沉默效率高、持续时间长、能够侵染分生组织应用， 目前应用最广泛VIGS载体)
VIGS的应用
• 品质改良相关基因的功能分析 • 2012，利用VIGS技术发现高分子量谷蛋白亚基HMVGS 1Bx14和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成有关。 • 这也是首次报道VIGS技术应用于小麦穗子和籽粒相 关的基因功能，同时这个体系的建立将会对研究与 籽粒品质和在小麦渐成的籽粒中有关基因的功能起 到很大帮助作用。
VIGS优点
• 在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下 即可进行VIGS分析。 • 操作简便，能快速获取表型。 • 无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获 取非常困难的植物种类来说至关重要 •可用于突变致死的基因功能研究。 •可用于功能冗余基因的功能研究。 •可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究 。
VIGS的应用
• 抗旱研究中相关基因的功能分析 • 2011，沉默小麦上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 (SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)、γ 谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(γ -ECS)三个基因。 • 沉默植株经干旱胁迫后较正常植株在形态上有明显 的变化，其叶片的卷曲萎蔫程度较为突出，说明这 三个基因在小麦抗干旱胁迫中具有重要功能。
What are RNAi?
• RNAi 现象早在 1993 年就有报道 : 将产生紫色素的基 因转入开紫花的矮牵牛中,希望得到紫色更深的花, 可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。 当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的 外来紫色素基因都失去了功能 , 称这种现象是“共 抑制”。 • 直到1998年, Fire等的研究证明,在正义RNA阻断了 基因表达的试验中 , 真正起作用的是双链 RNA, 使基 因“沉默”了。研究人员将这一现象称为 RNA 干扰 (RNA interference,RNAi) 。 研 究 者 因 此 获 得 了 2006年诺贝尔生理学或医学奖。
What are RNAi?
RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被 赋予不同的名称: •在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression） •在真菌中被称为基因阻抑（qulling） •在动物体内被称为RNA干扰（RNAi）
现今用于植物RNAi技术按导入方式的不同有粒子轰击、 病毒诱导基因沉默(VIGS)、农杆菌介导等方式。
VIGS缺陷
• VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以 致 VIGS 技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此 种技术自身最大的局限性。 • 如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术 目前需要解决的问题。 • 沉默持续的时间问题。 • 病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较 强的沉默效果，是 VIGS 技术实验操作中的关键性 步骤。
Virus Induced Gene Silencing(VIGS)
• 病 毒 诱 导 的 基 因 沉 默 (virus induced gene silencing,VIGS) • 是指通过对已知植物病毒的改造，将目标基因片 段整合入病毒载体中，然后侵染植物,诱发RNAi途 径,随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同 源基因 mRNA 降解或被甲基化等修饰，从而引起植 物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴 定。
PDS即八氢番茄红素脱氢酶，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿 素免受光漂白的作用，而PDS基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光 漂白症状。 PDS表型变异易于辨别，因此PDS基因成为VIGS体系评价的参照基因。
VIGS应用的载体
DNA病毒(载体构建简便、无需体外转录、操作难度 低) →1998,基于双生病毒番茄金色花叶病毒TGMV的VIGS 体系成功建立(第一例DNA病毒载体) →2004,非洲木薯花叶病毒ACMV →2008,棉花皱叶病毒CLCrV →2010,水稻东格鲁杆状病毒RTBV(实现农杆菌介导 接种高效沉默水稻內源基因PDS，第1例能够通过农 杆菌介导接种水稻的VIGS载体)
病毒诱导的基因沉默(VIGS)的获得
• • • • • • • • 1.设计引物(保守序列，200bp) 2.构建载体(γ ) 3.体外转录 (准备质粒，线性化质粒) 4.体外涂抹 5.观察病毒表型(BSMV) （提取RNA,反转录成cDNA,检测基因表达水平） 6.观察表型
VIGS原理
dsRNA:双链RNA; Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ (RibonucleaseⅢ, RNase Ⅲ) 家族的成员; siRNA:小干扰RNA ; RISC:RNA诱导沉默复合体
VIGS应用的载体
利用植物病毒作为载体的优点:
• 病毒能吸附到完整的植物细胞并将它们的核酸导 入到细胞中 • 感染的植物细胞产生大量的病毒，因此重组病毒 载体可以高效表达转入的外源基因。 • 病毒感染可以蔓延整个植株 • 病毒感染快
VIGS应用寄主
• 寄主范围有限，针对不同的寄主植物往往需要开发 不同的病毒载体。 • 2002，大麦抑制PDS（大麦条纹花叶病毒BSMV，进 一步在小麦上应用） • →2006，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒BMV • →2006，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒BPMV） • →2010，大豆（改造后无需体外转录，增加沉默效 率）
VIGS应用的载体
RNA病毒(最早最多) →1995,首次基于烟草花叶病毒TMV载体构建 (携带八 氢番茄红素脱氢酶PDS侵染烟草，上位叶片褪绿白化) →1998,马铃薯X病毒PVX(沉默PDS诱发白化效应) → 2001,烟草脆裂病毒 TRV(因其具有病毒症状较轻、 沉默效率高、持续时间长、能够侵染分生组织应用， 目前应用最广泛VIGS载体)
VIGS的应用
• 品质改良相关基因的功能分析 • 2012，利用VIGS技术发现高分子量谷蛋白亚基HMVGS 1Bx14和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成有关。 • 这也是首次报道VIGS技术应用于小麦穗子和籽粒相 关的基因功能，同时这个体系的建立将会对研究与 籽粒品质和在小麦渐成的籽粒中有关基因的功能起 到很大帮助作用。
VIGS优点
• 在未获取全长序列甚至事先不知道序列的情况下 即可进行VIGS分析。 • 操作简便，能快速获取表型。 • 无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获 取非常困难的植物种类来说至关重要 •可用于突变致死的基因功能研究。 •可用于功能冗余基因的功能研究。 •可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究 。
VIGS的应用
• 抗旱研究中相关基因的功能分析 • 2011，沉默小麦上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因 (SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(SAMDC)、γ 谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(γ -ECS)三个基因。 • 沉默植株经干旱胁迫后较正常植株在形态上有明显 的变化，其叶片的卷曲萎蔫程度较为突出，说明这 三个基因在小麦抗干旱胁迫中具有重要功能。
What are RNAi?
• RNAi 现象早在 1993 年就有报道 : 将产生紫色素的基 因转入开紫花的矮牵牛中,希望得到紫色更深的花, 可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。 当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的 外来紫色素基因都失去了功能 , 称这种现象是“共 抑制”。 • 直到1998年, Fire等的研究证明,在正义RNA阻断了 基因表达的试验中 , 真正起作用的是双链 RNA, 使基 因“沉默”了。研究人员将这一现象称为 RNA 干扰 (RNA interference,RNAi) 。 研 究 者 因 此 获 得 了 2006年诺贝尔生理学或医学奖。
What are RNAi?
RNA干扰广泛存在于生物界，在不同物种中RNA干扰被 赋予不同的名称: •在植物体中被称为基因共抑制（co-suppression） •在真菌中被称为基因阻抑（qulling） •在动物体内被称为RNA干扰（RNAi）
现今用于植物RNAi技术按导入方式的不同有粒子轰击、 病毒诱导基因沉默(VIGS)、农杆菌介导等方式。
VIGS缺陷
• VIGS引起目标基因的沉默特征不具有遗传性，以 致 VIGS 技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此 种技术自身最大的局限性。 • 如何获得目标基因的系统性沉默仍然是VIGS技术 目前需要解决的问题。 • 沉默持续的时间问题。 • 病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较 强的沉默效果，是 VIGS 技术实验操作中的关键性 步骤。
Virus Induced Gene Silencing(VIGS)
• 病 毒 诱 导 的 基 因 沉 默 (virus induced gene silencing,VIGS) • 是指通过对已知植物病毒的改造，将目标基因片 段整合入病毒载体中，然后侵染植物,诱发RNAi途 径,随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同 源基因 mRNA 降解或被甲基化等修饰，从而引起植 物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴 定。