核酶和抗体酶2

自体催化 异体催化
剪接型核酶
• 剪接型核酶的作用机制是通过既剪又 接的方式除去内含子 –具有核酸内切酶和连接酶两种活性 如： • I类内含子 • II类内含子
Ⅰ型内含子
• Ⅰ型自我剪接内含子在线粒体基因 组中发现，也存在于极少数单细胞 真核生物的核基因组中。
一类具有酶催化功能的内含子, 转录成RNA后，可以自我剪接。
+ 外显子1 外显子2 内含子1
•剪接产物通过凝胶电泳见到: rRNA前体 + + + + 核抽取物 - + - + GTP - + + -
rRNA前体 剪接后的外显子
环状内含子 线状内含子
蛋白质不是剪 接必需的成分!
需要鸟苷酸 (GMP, GDP, GTP)或鸟苷
重大发现（2）
• 1983年，Sidney Altman和他的研 究组也在《CELL》上发表了论文 《核糖核酸酶P的RNA部分是该酶 的催化活性亚单元》
RNA，RNA，RNA RNA，RNA，RNA，RNA
RNA，RNA，RNA RNA， RNA， RNA
RNA 世界
蛋白质
DNA
信息分子和功能分子是分离的 • 核酸是一类信息分子 • 蛋白质是一类功能分子
在生命的起源和分子进化中， 人们一直在争论一个问题
若是先有核酸， 那么是什么催化其合成呢？ 若是先有蛋白（酶）， 它们合成的模板又是什么？
• 核酶的发现给人们以启示 • RNA、DNA分子不但有复制的功能，含有
复制的信息，而且还有催化的功能。
核酸既是信息分子，又是功能分子。
先有RNA、蛋白质还是DNA？
生命是自我复制的体系
• 三种生物大分子，只有RNA既具有信息 载体功能又具有酶的催化功能。
2、异体催化剪切型
• 核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是 核糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前 体的5‘端，除去多余的序列，形成3’OH 和 5’-磷酸末端
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成
剪切位点
剪切位点
RNase P底物的二 级结构模型
边界顺序
• Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割位点， 发现有2个特点：
（Ribozyme)
知识回顾
核 脱氧核糖核酸（DNA） 酸 核糖核酸（RNA）
所有生物的遗传物质是：
绝大多数生物：DNA 部分病毒：RNA
核酸的组成
DNA
RNA
核酸的结构
DNA
DNA
RNA的种类、分布、功能
细胞核和胞液 线粒体 功
能
核蛋白体RNA rRNA
mt rRNA 核蛋白体组分
信使RNA
• ①内含子的两个末端并不存在同源或互补序列 • ②连接点具有很短的保守序列，也称为边界顺序
–100种内含子的5′端都是GT；3′端都是AG，因此称 为GT-AG法则，又称为Chambon法则
边界顺序
• 这两个位点序列是不同的，左边的剪接位点 称供体（donor）位点，右边的剪接位点称受 体（acceptor）位点。
• 这两个位点对于剪接是十分重要的，一旦发 生突变无论在体内还是在体外，会抑制剪接。
• 此法则几乎适合于所有真核生物的核基因， 这意味着它们切除内含子的机制是相同的， 但不适用于Ⅰ类内含子。
RNA的催化功能
• 核酶首先是美国 Colorado 大学Cech在研 究四膜虫rRNA剪接机制时发现的。
–一方面证明了四膜虫rRNA的剪接机制； –另一方面证明了L-19 分子的催化活性。
HDV核酶的斧头结构
基因组的负链
保守氨基 酸序列
反基因的正链
剪切部剪位切部位
链孢霉线粒体（VS）核酶
• VS核酶球状，由5个螺旋结构组成， 这些螺旋结构通过两个连接域连接 起来，这些连接域对于催化反应很 重要。
VS核酶的二级结构
I是底物区
II—VI是催化区
连接域
A730环上的A756功能基团非常重 要，目前认为是酶的活性中心。
四膜虫rRNA内含子 ---Ⅰ型内含子
I型内含子的结构特点
1、拼接点序列为 5U··· ···G3
2、中部核心结构 3、内部引导序列 4、剪接通过转酯反应进行
引导序列
保守序列 G结合位点
剪接部位
Ⅰ型内含子二级结构通式
内部引导序列
• 内含子中可与外显子配对的序列称为内部引导序列 • 其作用是决定剪接的专一性。
DNA
转录
hnRNA
转录后剪接 转运
mRNA 蛋白
翻译
内含子（introns）
• 真核生物细胞DNA中的间插序列 （interveningsequence，IVS）
• 在转录后的加工中，从最初的转录 产物除去的内部的核苷酸序列。
生物催化剂---酶
早期认识
酶是一种生物催化剂。由生物体 产生的，具有催化能力的蛋白质。 • 只有蛋白质才有催化功能，所有称为
• 在1983年，耶鲁大学Sidney Altamn发现 了第二个核酶，参与 tRNA 前体加工的 RNaseP。
• 1992年，加州大学的Harry Noller又证明 了核糖体大亚基rRNA的催化活性。
核糖体
• 核糖体就是一种核酶
肽键的形成是由r RNA催化 rRNA 可能是一个肽基转移酶
rRNA在蛋白质合成中的作用
L-19IVS是四膜虫35S rRNA剪接的最终 产物，仍具有酶的活性和特征。
rRNA
四 膜 虫 前 体 自 我 剪 接 反 应
G-OH
内含子(413nt)
外显子 A
5’
P
外显子 B -P
P-
OH-
水解
L-15 IVS
G- P
-P
+
-OH
-P +
+ 4nt
环状 IVS 395nt
水解
G- P
-OH
和传统酶的区别
• 一般的酶是纯的蛋白质，而核酶 是RNA或带有蛋白的RNA。
• 核酶既是催化剂又是底物，而蛋 白质酶仅催化反应。
与蛋白质酶相比，核酶的催化效率 较低，是一种较为原始的催化酶。
核酶的分类
I型内含子 剪接型核酶
自 我 剪
II型内含子
接
锤头核酶 剪切型核酶 发夹核酶
丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNaseP
• 分布：在绿色植物、真菌等真核生物的 mRNA、tRNA和rRNA基因中
• 区别：由内含子3’端腺苷酸2’-羟基攻 击5’磷酸基引起
• 内含子形成套索（lariat)结构，被切除
Ⅱ类内含子二级结构模式
Ⅱ类内含子有一个保守的二级 结构： • 结构域Ⅰ：两个保守内含子结 构序列EBS1,EBS2与两个外显 子结构序列IBS1,IBS2互相配 对。 • 结构域Ⅴ：高度保守，催化活 性必需。 • 结构域Ⅵ：未配对的A， 提供 2‘-OH
内含子
Ⅰ
型
5'外显子
5'
U pA
3'外显子
G pU
3'
内
第一次转酯反应
含
pG-OH
子
pGpA
的 5'
UOH
G pU
3'
自
我
第二次转酯反应
剪
5' pGpA
接
5'
U pU
3'
GOH 3'
I类内含子催化其他RNA分子 反应的几种类型
1、转核苷酸作用
2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC+CpCpCpC
未配对的A
Ⅱ
类
内
含
子
的
剪
接
机
制
剪接的两次转酯反应
I型内含子和II型内含子自剪接反应过程的区别
剪切型核酶
• 这类核酶的作用是只剪不接，催化自 身RNA或不同的RNA分子，切下特异的 核苷酸序列。 –相当于核酸内切酶
• 自身催化剪切型
• 异体催化剪切型
1、自体催化剪切型
锤头状核酶的结构及特点
• 三个双螺旋区。 • 13个核苷酸残基保守序列。 • 剪切反应在右上方GUX序列的3‘端自动发
• 剪切反应发 生在底物识 别序列GUC 的5‘端。
肝炎δ病毒（HDV）核酶
• 目前唯一的一种在哺乳动物细胞内具 有天然核酶活性的动物病毒，来源于 肝炎δ病毒的反义RNA和基因组RNA， 为单股环状负链RNA病毒。
结构特点：
有三个由碱基配对形成的茎，剪切时 需要二价阳离子参与，结果产生5‘OH和 2’, 3’-环磷酸
• (1)与mRNA相互作用 • (2)与tRNA相互作用 • (3)在核糖体大小亚基联合中的作用 • (4)rRNA参与催化肽键形成
脱氧核酶
• 脱氧核酶具有催化活性的单链DNA片段。
单链DNA由于没有2′羟基，其催化潜 能大大降低，自然界中就没有发现催 化性DNA的存在。
人们利用体外筛选的方法，已经获得 了一些具有催化功能及其他一些功能 的DNA分子。
中心法则
遗传信息复制
遗传信息转换
遗传信息 最终表达
蛋白质合成时形成的复合体
卸载了氨基酸的tRNA
氨基酸
肽链 N-末端
退位
E位
A位
核糖体大亚基
5'
核糖体小亚基
P位
携带了氨基酸的tRNA
进位
核蛋白体移动方向 3'
mRNA
中心法则
原核细胞
DNA
mRNA
蛋白
转录
翻译
真核细胞
细胞质
细胞核
外显子
内含子
1983年Altaman等人报道：
• 在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参 与下，RNase P中的 RNA能够切割 tRNA前体5'端。
• RNase P中的蛋白组分没有催化功能， 只是起稳定构象的作用。
这两个发现，宣告了分子生物学 一个新的RNA时代的来临
1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Ahman被授予 诺贝尔化学奖。
2、水解作用
CpCpCpCpC CpCpCpC + pC
3、转磷酸作用
CpCpCpCpCpCp+UpCpU
CpCpCpCpCpC + UpCpUp
4、去磷酸作用
CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi
5、限制性内切酶作用
CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN
II型内含子(group II intron)
酶的生物大分子都是蛋白质。
重大发现（1）
• 1982年，Thomas R.Cech的研究组在 《CELL》上发表了题为《自我剪接RNA： 嗜热四膜虫核糖体RNA插入序列的自我 切除和自我环化》
重大发现
• 四膜虫 rRNA前体中的内含子具 有催化活性，它能自动切除内含 子本身，并连接外显子得到成熟 的rRNA。
mRNA
mt mRNA 蛋白质合成模板
转运RNA
tRNA
mt tRNA 转运氨基酸
核内不均一RNA HnRNA
成熟mRNA的前体
核内小RNA
SnRNA
参与hnRNA的剪接、转运
核仁小RNA
SnoRNA
rRNA的加工、修饰
胞浆小RNA scRNA/7SL-RNA
蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分
催化反应是在没有任何蛋白质酶的 存在下发生的，称为自我剪接。
四膜虫rRNA前体的自我剪接
rRNA的自我剪接(2)
• 释放出的线形内含子序列再经过两次 连续的转酯反应，释放出15核苷酸和 4核苷酸的两个小片段，最终形成稳定 的线形产物L-19IVS。
自我剪接催化过程需要鸟苷酸 或鸟苷以及镁离子参与。
L-19IVS
G- P
- OH +
15nt
P399nt
图 13- 四膜虫 35S RNA 内含子剪接 的转酯反应模型
L-19具有酶的主要特 征：专一性强，加快 反应速度，反应前后 酶分子保持不变
L-19 IVS所催化的水解反应和连接反应
四膜虫rRNA内含子的二级结构和三级结构
异议
• 催化作用是由与前体rRNA紧密结合的 蛋白质所起的作用
核酶研究的意义
• 对传统酶学的挑战 • 揭示了内含子自我剪接的奥秘，促进了
RNA的研究 • 为生命的起源和分子进化提供了新的依据 • 利用核酶的结构设计合成人工核酶
突破了“酶是蛋白质”的传统概 念
现代的酶定义：酶由生物体内活细胞产 生的、具有催化功ห้องสมุดไป่ตู้的生物大分子。
核酶的发现是对传统酶学的挑战
为生命的起源和分子进化提供了新的依据
切赫 (Thomas Robert Cech)
阿尔特曼 (SidneyAhman)
核酶
• 具有催化功能的RNA称为核酶 (ribozyme，Rz)
• 具有催化功能的DNA称为脱氧核酶 (deoxyribozyme，DRz)
二者统称核酶(nucleozyme)
核酶的功能很多，有的能够切割 RNA， 有的能够切割DNA，有些还 具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。
生。
发夹（hairpin ）结构
• 1989年汉普（Hample）研究烟草环斑病毒 （sTRSV）的负链RNA的自我剪切反应，提 出发夹结构（hairpin structure）模型。
• 发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应 中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核 酶高。
发夹二级结构模型
• 当发夹核酶 与底物结合 时，其二级 结构包括5 个环和4个 螺旋。
解决方法1
为防止少量酶含在其中造成假象 大量的SDS-酚来抽提以较彻底地脱蛋白 或用蛋白酶来处理
• 结果仍然可以自主剪接
解决方法2
重组DNA
将四膜虫rRNA基因中 413bp与其两翼的序列
进行分子克隆
转录出相应RNA SDS-酚抽提
结论 电泳检测
四膜虫rRNA前体自我剪接的发现
外显子1 内含子1 外显子2