蛋白质CD光谱定性解析_总结.

蛋白质的圆二色性

(1由氨基酸通过肽键连接而成;

(2光学活性基团:肽键、芳香氨基酸残基、二硫桥键;

(3蛋白质有多个结构层次,相同的氨基酸序列,因蛋白质的折叠结构不同,基团的光学活性受到影响。

蛋白质的圆二色特征

(1光学活性基团及折叠结构;

(2250nm以下的光谱区,肽键的电子跃迁引起; (3250~300nm光谱区,侧链芳香基团的电子跃迁引起; (4300~700nm光谱区,蛋白质辅基等外在生色基团引起。

蛋白质 CD 光谱的波长范围:远紫外区(185-245nm 、近紫外区(245-320nm

分子构象

电子跃迁形式极值的波长

[θ]*103 Deg.cm 2/dmol

α-螺旋(α-helix

n → π﹡π→ π﹡

221~222nm(- 207~210nm(- 191nm(+ -38~-40 -36~-40 72~86 β-折叠(β-sheet n → π﹡π→ π﹡

217~218nm(- 195~197nm(+

-19~-21 28~42 β-转角(β-turn

n → π﹡π→ π﹡

227nm(- 弱 200~205nm(+ 192.5(-强

无规卷曲 (random coil

π→ π﹡

230nm(- 215~218nm (+

195~202nm(-强

-1.6 1~2 -25~-50

圆二色谱法分析多肽二级结构

圆二色谱是一种特殊的吸收谱, 它通过测量蛋白质等生物大分子的圆二色光谱,从而得到生物大分子的二级结构,简单、快捷,广泛应用在蛋白质折叠,蛋白质构象研究,酶动力学等领域。

圆二色谱紫外区段 (190-240nm , 主要生色团是肽链, 这一波长范围的 CD 谱包含了生物大分子主链构象的信息。α-螺旋构象的 CD 谱在 222nm 、 208nm 处呈负峰,在 190nm 附近有一正峰。β-折叠构象的 CD 谱,在 217-218nm 处有一负峰,在195-198nm 处有一强的正峰。无规则卷曲构象的 CD 谱在 198nm 附近有一负峰,在220nm 附近有一小而宽的正峰。

蛋白浓度与使用的光径厚度和测量区域有一定关系, 对于测量远紫外区德氨基酸残基微环境的蛋白而言 ,浓度范围在 0.1~1.0mg/ml, 则光径可选择在

0.1~0.2cm之间,溶液体积则在 200~500ul。而测量近紫外区的蛋白质三级结构, 所需浓度要至少比远紫外区的浓 10倍方能检测到有效信号,且一般光径的选择均在

0.2~1.0cm,相应的体积也需增加至 1~2mL

缓冲液可选 50~100mmol trs-HCl、 PBS 等,尽量除去 EDTA 。

远紫外

近紫外

二硫键一般都是不对称的,它在圆二色性光谱上,于 195-200nm 和 250-260处有谱峰

色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸残基的侧链其谱峰在 230-310nm 之间,色氨酸残基侧链的谱峰一般集中在 290- 310nm之间, 但有时也会向短波长方向移动从而与酪氨酸残基侧链的谱峰重叠

在 250-260nm 之间,苯环的谱峰又与二流键的谱峰重叠