双元表达载体系统

双元表达载体系统

双元表达载体系统主要包括两个部分：

一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T—DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA (T-DNA)两端24bp序列，进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T—DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid),它在T—DNA左右边界序列之间提供植株选择标记女口NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T—DNA的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

|原理

1•一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS 和筛选标签的融合蛋白(通常是GFP或Gus)的普通载体。另一个载体就是双元载体(binary-vector )了。通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-

expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的

LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组

上。我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2•双元表达载体系统主要包括两个部分3•一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T—DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T—DNA的转移。4•另一

部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T—DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。5•双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的ir基因可以反式激活T—DNA的转移。与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。6•外源DNA克隆到微型Ti质粒T—DNA左右边

界序列之间

双元载体

标签：植物双元表达载体

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够通过感染植物的伤口，将其Ti质粒上一段含有植物激素和冠瘿碱合成酶基因的DNA转移并整合至植物受

体的基因组中。Ti质粒中的2个独立的区域决定DNA转移及整合：T-DNA区(transferredDNA) 和vir区(virlenee region)。基于Ti质粒这个结构特点，1983年Hoekema等提出双元载体策略：将去除致瘤基因的T-DNA区从Ti质粒中分离，放置在一个能在农杆菌和大肠杆菌中复

制的穿梭质粒中。这个穿梭载体称为双元Ti载体。vir区则存在于一个已经除去T-DNA的Ti 质粒中，在农杆菌中作为辅助质粒，通过反式激活使T-DNA转移到植物细胞基因组中。由

于双元Ti载体的体积小而非常便于基因克隆操作，所以逐渐取代了其它形式的Ti载体，已成为植物基因工程中最重要的植物转化载体。

(1))病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性

所决定的。以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源荃因整合到植物细

胞基因组中。植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载

体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。

作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。目前己有十几种植物病毒被改造成不同类

型的外源蛋白表达载体中：包括椰菜叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)、更豆花叶病毒(CPMV)和马铃薯X病毒(PVX等。其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。

(2)农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有:Ti质粒和Ri质粒。r

质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens )中，Ri质粒存在于发根农杆菌(Agxobac[erium tlhixogenis)中。r质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有荃本一致的特性。但实际工作中，绝大部分采用五质粒。农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和

整合的天然系统。r质粒有两个区域:T -DNA区〔是质粒上能够转移整合入植物受体墓因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘦瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域)和Vir

区(编码能够实现TDNA转移的蛋白)。TDNA长度为12 一24kb之间，两端各有一个含25hp 重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的TDNA可以转移并整合到宿主细

胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的TDNA并

不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。Vir区位于TDNA以外的一个35kb内，其

产物对TDNA的转移及整合必不可少。农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口，受伤

植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达。Vir产物能诱导Ti质粒产生一条新

的TDNA单链分子。此单链分子从五质粒上脱离后，可以与场r产物VIRD2蛋白共价结合，

并在V [RD4和V IRE等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。由于野生型Ti质粒过于庞大，约200 一SOOkb，为了便于重组DNA操作，研究人员对Ti质粒进行了改造从