生物分子的分离纯化课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失， 样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后 续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。
• 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， • 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
细胞 细胞悬液 红细胞 细菌、病毒
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
影响提取效果的因素
（1）pH值 （2）盐浓度（即离子强度） （3）温度 （4）水解酶 （5）搅拌与氧化 （6）有机溶剂
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度；
3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时 应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
保持核酸的完整性
在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
⒉ 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法 皆可用于核酸制品的纯度鉴定。
⑴ 紫外分光光度法：该法主要通过A260与 A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE 缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA 的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中， 核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以 及和其他生物大分子结合的方式。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
来自百度文库
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对 酶有抑制作用的有机溶剂；
材料的破碎和预处理 分离纯化方案的选择和探索
最困难 的过程
要求达到一维电泳一
产物纯度的鉴定
条带，二维电泳一个
点，或HPLC和毛细
产物的浓缩，干燥和保存。
管电泳都是一个峰
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样， 主要是利用它们之间理化性质的差异。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提 法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的 甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质）， 然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和 有机溶剂。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
1.回收率 为提高DNA片段的回收率，可 通过提高DNA样品的上样量和选择适宜 的方法与材料而实现。
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖 及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
⑵ 荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭 （ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后， 本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光， 且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正 比。
含蛋白溶 液透析袋
透析液 磁子
电磁搅拌器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
二、核酸的分离纯化
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。
• 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
⑵ 其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定 RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某 种mRNA的Northern杂交等
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
1
生物大分子的分离纯化 （ ） 盐 析 法
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
（2）有机溶剂沉淀法
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
(3) 透析 (dialysis)
利用透析袋 把大分子蛋 白质与小分 子化合物分 开的方法。
一、生物大分子的制备 生物大分子指的是作为生物体内主要 活性成分的各种分子量达到上万或更 多的有机分子。常见的生物大分子包 括蛋白质、核酸、脂类、糖类。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物大分子的制备有以下主要特点：
（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法 可通用于各种生物大分子的分离制备；
1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键) 2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破 坏磷酸二酯键) 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核 酸 制 备 的 技 术 路 线
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光
光度法与荧光光度法进行。 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱
基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线， 其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。
该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb， 适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
基因组DNA片段的纯化
纯化的原则与要求 纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀 等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化 与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则： 一是提高片段的回收率； 二要清除回收的DNA样品中的污染。
（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估 计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
真核基因组DNA的分离纯化
尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的 不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分 离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试 剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯 化的一般程序见图7-4。
该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用 于制备大片段DNA
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
3、玻棒缠绕法
用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代， 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改 进而来。 本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带 钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转 移至pH8.0的TE缓冲液中。
医学分子生物学 ∙ 第七章
生物分子的分离纯化
123
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类 分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组 成生命的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等）
生物大分子（蛋白质、核酸、糖 复合物等）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
裂解液中： EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞 膜稳定性 SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并 使其变性沉淀，同时变性DNase 无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质 酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防 止DNA变性
• 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 • DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定
了两者的最适分离与纯化条件的不同
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
分离纯化的原则
一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清 除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
真核 基因 组DNA 分离 纯化 的一 般技 术路 线
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
1、酚抽提法
本法最初于1976年由Stafford及其同事提出， 通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂 解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定 纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获 得所需的DNA样品。
⑵ 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸 电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
⒊ 完整性鉴定
⑴ 琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结 果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖 尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条 带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示 有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带， 则说明存在DNA 的污染。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
常用破碎方法
破碎方法
应用
机械法 化学法 物理法
研磨法 匀浆法 捣碎法 酶解法 去垢剂 有机溶剂 反复冻融法 超声波法 低渗裂解法 冷热交替法
细菌、酵母 机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 组织、细胞 细菌、酵母
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物大分子制备的一般步骤：
确定制备的目的和要求 建立相应的可靠的分析测定方法
科研、开发或 发现新的物质
制备的关键
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便
文献调研和预备性实验
掌握目的产物 的理化性质
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。
（二）核酸的保存
(1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保 存；在-70℃可保存数年 ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双 蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒 核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。
核酸的浓缩、沉淀与洗涤
• 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失， 样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后 续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。
• 沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法， • 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
细胞 细胞悬液 红细胞 细菌、病毒
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
影响提取效果的因素
（1）pH值 （2）盐浓度（即离子强度） （3）温度 （4）水解酶 （5）搅拌与氧化 （6）有机溶剂
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子 的污染应降至最低程度；
3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时 应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
保持核酸的完整性
在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对 核酸的破坏。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
⒉ 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法 皆可用于核酸制品的纯度鉴定。
⑴ 紫外分光光度法：该法主要通过A260与 A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE 缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA 的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。
意义：遗传信息全部储存在一级结构之中， 核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以 及和其他生物大分子结合的方式。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
来自百度文库
对于核酸的纯化应达到以下三点要求：
1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对 酶有抑制作用的有机溶剂；
材料的破碎和预处理 分离纯化方案的选择和探索
最困难 的过程
要求达到一维电泳一
产物纯度的鉴定
条带，二维电泳一个
点，或HPLC和毛细
产物的浓缩，干燥和保存。
管电泳都是一个峰
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样， 主要是利用它们之间理化性质的差异。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
2、 甲酰胺解聚法
1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解 聚法，该法的细胞裂解与蛋白质水解同酚抽提 法相似，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的 甲酰胺裂解DNA与蛋白质的复合物（即染色质）， 然后通过火棉胶袋的充分透析以除去蛋白酶K和 有机溶剂。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
1.回收率 为提高DNA片段的回收率，可 通过提高DNA样品的上样量和选择适宜 的方法与材料而实现。
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖 及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
⑵ 荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭 （ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后， 本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光， 且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正 比。
含蛋白溶 液透析袋
透析液 磁子
电磁搅拌器
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
二、核酸的分离纯化
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。
• 无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需 要对核酸进行分离和纯化。
⑵ 其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定 RNA的完整性。 如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某 种mRNA的Northern杂交等
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
1
生物大分子的分离纯化 （ ） 盐 析 法
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
（2）有机溶剂沉淀法
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
(3) 透析 (dialysis)
利用透析袋 把大分子蛋 白质与小分 子化合物分 开的方法。
一、生物大分子的制备 生物大分子指的是作为生物体内主要 活性成分的各种分子量达到上万或更 多的有机分子。常见的生物大分子包 括蛋白质、核酸、脂类、糖类。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物大分子的制备有以下主要特点：
（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法 可通用于各种生物大分子的分离制备；
1）温度不要过高(0～4℃)；(高温破坏氢键) 2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破 坏磷酸二酯键) 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核 酸 制 备 的 技 术 路 线
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1. 浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光
光度法与荧光光度法进行。 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱
基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线， 其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。
该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb， 适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
基因组DNA片段的纯化
纯化的原则与要求 纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀 等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化 与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则： 一是提高片段的回收率； 二要清除回收的DNA样品中的污染。
（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估 计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各 种组份的综合影响
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度； （4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
真核基因组DNA的分离纯化
尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的 不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分 离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试 剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯 化的一般程序见图7-4。
该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用 于制备大片段DNA
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
3、玻棒缠绕法
用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代， 现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改 进而来。 本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞 裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带 钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转 移至pH8.0的TE缓冲液中。
医学分子生物学 ∙ 第七章
生物分子的分离纯化
123
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类 分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组 成生命的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等）
生物大分子（蛋白质、核酸、糖 复合物等）
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
裂解液中： EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞 膜稳定性 SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并 使其变性沉淀，同时变性DNase 无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化 蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质 酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性 pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防 止DNA变性
• 核酸样品质量将直接关系到实验的成败。 • DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定
了两者的最适分离与纯化条件的不同
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
分离纯化的原则
一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清 除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
真核 基因 组DNA 分离 纯化 的一 般技 术路 线
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
1、酚抽提法
本法最初于1976年由Stafford及其同事提出， 通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂 解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定 纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获 得所需的DNA样品。
⑵ 荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸 电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较 RNA大得多，电泳迁移率低。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
⒊ 完整性鉴定
⑴ 琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结 果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖 尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条 带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示 有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带， 则说明存在DNA 的污染。
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
常用破碎方法
破碎方法
应用
机械法 化学法 物理法
研磨法 匀浆法 捣碎法 酶解法 去垢剂 有机溶剂 反复冻融法 超声波法 低渗裂解法 冷热交替法
细菌、酵母 机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 组织、细胞 细菌、酵母
Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics
生物大分子制备的一般步骤：
确定制备的目的和要求 建立相应的可靠的分析测定方法
科研、开发或 发现新的物质
制备的关键
④③②① 使灵准特 用敏确异 快度度性 捷高高强 方 便
文献调研和预备性实验
掌握目的产物 的理化性质
根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型： （1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、 盐析法、分配层析法、分级沉淀法等； （2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等； （3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等； （4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、 电泳、等电聚焦法等。 （5）根据配体特异性，如亲和层析。
（二）核酸的保存
(1) 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4 ℃或-20 ℃保 存；在-70℃可保存数年 ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
(2) 对RNA ① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双 蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒 核糖核苷复合物)冻贮于-70℃,可保存数年。