关于基因工程菌的稳定性

关于基因工程菌的稳定性
摘要：研究了定态与周期操作对基因工程酒精酵母质粒稳定性的影响,周期操作有利于提高底物的利用率并增强质粒的稳定性；发现了固定化重组菌高稳定性的原因，另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。

关键字：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性；基因工程
基因工程菌就是将目的基因导入细菌体内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌成为基因工程菌。

基因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的现象。

质粒不稳定可分为：分裂不稳定和结构不稳定。

分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。

结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。

1 常见分裂不稳定的两个因素：
1.1 含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；
1.2 这两种菌比数率差异的大小。

2 提高质粒稳定性的方法
2.1 选择合适的宿主菌；
2.2 选择合适的载体，适当增加质粒拷贝数；
2.3 加入选择性压力；
2.4 采用两阶段培养法；
先使菌体生长至一定密度，再诱导外源基因的表达。

由于第一阶段外源基因未表达，减小了重组菌与质粒丢失菌的生长速率的差别，增加了质粒稳定性。

在培养基中加入抗菌素抑制质粒丢失菌的生长，提高质粒稳定性。

调控环境参数如温度、pH、培养基组分和溶解氧浓度。

有些含质粒菌对发酵环境的改变比不含质粒菌反应慢，间歇改变培养条件以改变两种菌比生长速率，可改善质粒稳定性。

通过间歇供氧和改变稀释数率，都可以提高质粒稳定性。

2.5 控制工程菌的培养条件；
2.6 采用固定化培养
基因工程技术是生物技术的核心和关键,已成功地表达了一系列与人类健康有关的重要多肽物质以及使多种氨基酸和抗生素增产,对人类社会生活产生了深远的影响。

基因工程菌中质粒稳定性问题是影响基因工程菌实现规模生产的一个重要因素,这种不稳定性主要表现为两种形式:一种是重组ＤＮＡ质粒的丢失,称为脱落性不稳定;另一种是质粒中的基因结构发生突变,称为结构性不稳定。

这两种不稳定都能使细胞失去生产能力。

质粒的稳定性与宿主及载体的特性有关,也与培养条件有密切的关系。

通过优化培养条件以提高质粒稳定性正是工程人员要做的工作。

很多学者已从不同方面探讨了提高质粒稳定性的方法，但实施起来均存在一定困难。

1988年Weber等尝试在基因工程大肠杆菌的培养中采用周期操作方式,从一定程度上提高了质粒的稳定性。

由于该方法简单易行,这方面的研究已引起国内外学者的广泛关注。

本文以基因工程酵母菌为例,初步探讨振荡式操作方式对基因工程菌质粒稳定性的影响,为进一步开发非线性调控技术奠定基础。

重组DNA技术可以提供具有极强选择性和累积目的代谢物能力的菌株，但为了进一步降低这些代谢物的生产成本，还需建立高效的生物转化体系及优化重组菌的培养环境以期获得最佳表达。

虽然“基因型加上环境等于表现型”，但微生物的环境控制经常被人们忽视或缺少认识。

事实上，重组
菌的最佳培养条件通常是与环境控制紧密相联的，因为微生物对环境理化性质的微小变化都十分敏感。

工程菌生物反应器的反应性很大程度上受非转化细胞繁殖程度的影响。

这种现象在中试及工业生产水平上也存在并使得重组菌的应用大受限制。

连续培养及批式培养中出现的非转化子(P-)均是由转化细胞(P＋)退行而来的。

可能缘于两种机制：分离不稳定性和结构不稳定性。

前者源于一个不同细胞间质粒DNA分离的不完全系统；后者则是因质粒结构改变而引起。

这些改变包括在质粒DNA 上的缺失、插入和重排。

由此而产生的P-细胞则不具备产生目的代谢物的能力，而P＋细胞因需合成更多的DNA、mRNA及蛋白而在生长上滞后于P-细胞。

同时它们还必须与染色体基因竞争合成目的物所需的前体(如核苷酸、氨基酸等)，而且P＋细胞的生长还依赖于质粒的数目、大小和蛋白产物的毒性等。

所以，一旦在反应体系中产生P-细胞，就会导致体系中具有不同特性的P＋、P-细胞共存，进而使反应后期几乎不再有什么收益。

由于重组子的稳定性受遗传及环境因素两方面的控制，所以可以通过基因水平的控制和限制反应器中P-细胞的繁殖来加以提高。

据此，Ensley提出了“选择性和非选择性”的概念。

“选择性”包括：1)在反应器中保持抗生素压力；2)通过质粒进行营养缺陷型互补；3)噬菌体抑制及4)转化子中自杀蛋白的表达。

而“非选择性”方法包括：1)引入分离位点而使子细胞在分化过程中获得好的分离；2)插入一段生长基因及3)培养条件的控制。

而质粒的稳定性不受培养过程中是否通氧影响。

另外人们还采取了将菌体繁殖与产品转化分开两步进行的措施。

尽管进行了诸多优化生物反应器的尝试，但在工业规模的生产中均未获得成功。

人们发现如将基因工程及酶工程相结合则大规模培养过程中重组菌的稳定性问题可能会得到较好的解决。

最近已有一些固定化基因工程菌用于生产的报道，与传统培养方法相比，已显示出了一定的优势，如在稀溶液体系中具有较高的细胞浓度；克隆产物可长期生产；细胞可以得到介质的保护；无需进行产物分离；反应器中可积累高浓度产物，获得较好的传质特性；且整个方法便于自动化控制等。

3 固定化及游离工程菌稳定性的比较
将游离及固定化重组菌加以比较后发现，后者具有高细胞浓度、克隆产物高效表达、可长期保持质粒等特性。

3.1 质粒的遗传稳定性
质粒的遗传稳定性是基因工程细胞最重要的因素，因为质粒是表达目的基因产物的载体。

在固定化体系中P+细胞可稳定地遗传55代，传到第18代时，P+细胞量是游离细胞的3倍。

比较了游离的和固定化的细胞在基础和LB培养基中的质粒遗传稳定性，发现在两种培养基中固定化细胞质粒的遗传稳定性较高。

与此相似，质粒PTG201可稳定存在于3种固定化的E.coli中。

在通纯氧的固定化体系中质粒的稳定性和拷贝数可较好地维持，到第200代时仍接近初始的100%。

与之相似，热稳定性淀粉酶基因在硅酮泡沫中可维持稳定。

用棉布固定化可使pBR322在E.coli中维持较高稳定性。

具广泛宿主的自转染质粒PR4或与其类似的质粒，通常用作G细菌的载体完全整合入染色体中，在其宿主M.xan被固定化后也获得了良好的稳定性。

在研究了稳定对pTG2014质粒在E.coliW3101中稳定性的影响后发现，儿茶酚-2，3-二氧化酶的产量在解抑制温度42℃时有所提高，但质粒稳定性有所下降。

但若采用两步连续培养则可克服质粒的低稳定性问题。

第一步是固定化细胞在31℃表达抑制的情况下生长以防pTG201的丢失；被释放的细胞被连续地泵入第二步反应器，并于42℃解抑制的状态生产高水平的儿茶酚-2，3-二氧化酶。

相似的两步连续培养也曾被Barbotin 等人采用。

第一步中的细胞在与前述方法相同的抑制状态下生长，在第二步中3-β-吲哚丙烯酸加入到体系中以利于色氨酸操纵子解抑制物的作用而提高eylE基因的翻译水平。

在游离情况下连续分批培养重组菌，则会观察到质粒的稳定性存在着波动，而这种波动会在固定化体系中得到修正。

总之，与游离细胞体系相比，固定化技术可以明显提高基因工程细胞稳定性和目的基因表达产
物的产量，并能保持宿主中质粒的稳定性和拷贝数。

4 固定化重组细胞的特点及质粒稳定性的原理
早期的观点认为固定化有利于维持重组体培养的稳定性，现在文献中相当多的资料表明在固定化条件下，不仅可以提高重组菌的稳定性还可以产生更多的克隆基因产物。

其优点大致总结如下：1)许多质粒载体具有了更高的稳定性；2)结构不稳定和缺失现象减少或消失；3)初期菌株适应期消失了；4)避免了在游离培养中因延长菌体生长期而出现的波动；5)使宿主中质粒拷贝数在更长时间内保持不变；6)由于胶粒的机械特性使得P+和P-细胞在胶粒中不存在竞争；7)允许少数几代P-细胞在脱离胶粒之前与P+细胞竞争；8)在细胞脱离胶粒之前限制其分裂数；9)脱落的细胞在完成多次分裂之前就被洗脱；10)由P+细胞衍生而来的P-细胞在固定化体系中被位于胶粒更深处的新细胞不断补充，这些细胞的生长最初曾由于营养或氧气的缺乏而受到抑制；11)可以获得更高密度的细胞和大量的克隆基因表达产物，因而可以减少反应器体积；12)便于大量减少回收费用。

在固定化体系中质粒稳定性的提高不能用单一的因素来解释。

虽然P+和P-细胞之间有紧密的联系，但事实证明质粒在固定化细胞中的转移是不存在的。

早期提出的隔室化理论并不能解释高稳定性，因为细胞长到第6代就足以将胶粒内部的空间充满。

带有pTG201质粒的P+和P-细胞以87%和13%的比例共同固定化后繁殖了约80代，最后P+和P-细胞在胶粒中比例不变，而与游离细胞体系大不相同。

这样就证明了质粒稳定性的提高归功于P-和P+细胞无法在胶粒中竞争［10］，以及固定化细胞在胶粒中繁殖缓慢的原因［24］。

同时微环境在通过稳定性方面也发挥了很重要的作用。

对于固定化体系可以保护基因的稳定性至今尚无一个确定的解释。

然而，对于克隆基因分泌产物及其调控机制以及固定化细胞生理学的全面了解可以为重组细胞高稳定性提供更多的信息。

就形态和通透性而言，观察重组细胞内部、细胞膜、细胞壁组成的变化是很重要的。

它可以增加对重组菌中质粒高稳定性的了解。

5 培养条件对质粒稳定性、菌体量及克隆基因产物的影响
游离细胞体系，固定化体系影响因素有接种量、各种介质、胶粒体积、基质浓度、营养缺陷、温度、pH以及溶氧浓度等。

随着基因工程技术的迅速发展及其产业化进程的深入，提高重组菌的稳定性以减少其遗传蜕变、降低生产成本等问题越来越为人们所关注。

而固定化，这种传统的生物工程技术必将再次焕发它的青春。

参考文献：
[1] 陈志宏;吴梧桐;聂凯. 固定化——提高基因工程菌稳定性的新策略. 药物生物技术, 1999年, 第2期第6卷.
[2] 马士洪, 都绛瑛, 曲天明等. 固定化细胞膜反应器生产6-APA的研究. 生物工程学报，1992年, 第2期第8卷.
[3] Weber A E, San K Y.Enhanced plasmid maintenance in a CSTR upon square-w ave oscillations in the dilution rate.Biotechnol Lett, 1988, 10∶531.
[4] It alura K, Hirose T, Crea R, et al.Expression in E.coli chemiscally synthesi zed gene for the hormone somatostatin.Science, 1977, 198∶1056.
[5] Sayadi S, Nasri M, Barbotin J N, et al.Effect of enviromental growth conditions on plasmid stability, plasmid copy number, and catachol-2,3,-dioxy genase activity in free and immobilized E coli cells.Biotechnol Bioeng, 1989, 33∶801.。