中性粒细胞介导肠道缺血再灌注损伤中的作用

中性粒细胞介导肠道缺血再灌注损伤中的作用郄文斌屠伟峰广州军区广州总医院全军临床麻醉中心（广州510010）严重的创伤、感染、休克均可伴有不同程度肠道血流量减少，导致肠功能障碍，在此基础上随着血供的恢复，组织器官的损伤反而加重，表现为肠道缺血/再灌注(GIR) 损伤。

肠道是缺血/再灌注损伤（IRI）最敏感的组织之一[1]。

业已证实，肠缺血再灌流是严重创伤、烧伤后全身性炎症反应综合征(SIRS)及多器官功能障碍综合征(MODS)发生、发展的重要诱因[2]。

肠道系统不仅仅是体内最大免疫器官，而且是激发和诱生各种炎性介质和细胞因子、介导嗜中性粒细胞（PMN）激活的中心器官“motor”。

有实验表明：PMN是引起组织损伤，乃至多器官功能衰竭(MOF)的关键细胞[3,4]。

PMN的激活趋化、聚集于靶组织与释放大量炎性介质和细胞因子是导致局部组织损伤和远离脏器损伤发生的主要途径。

一PMN的激活和趋化正常生理状况时，组织中较少见PMN，而循环系统血液中的循环粒细胞、边缘粒细胞以及储存在骨髓中大量的成熟PMN，在激活因子和趋化因子作用下被激活，继而侵入炎症组织中。

肠道缺血再灌注后肠血管可能作为“预激床”，在激活因子（包括细菌、毒素、免疫复合物、补体、氧自由基、白介素类等）作用下激活循环中的PMN。

其机理为激活因子通过与PMN细胞膜表面的相应受体结合（如C5a与PMN表面C5a受体结合），将信号传递给GTP结合蛋白，特异性磷酸脂酶激活磷脂酰肌醇，并在此酶的作用下，产生一系列代谢产物，激活蛋白激酶Ｃ，引起细胞内Ca2＋浓度升高，从而激活PMN[3,5]。

激活的PMN在趋化因子(包括补体C3a，C5a，IL-8，LPS和激肽释放酶等)和粘附分子的作用下与血管内皮细胞(VEC)粘附并进入组织中。

二PMN对内皮细胞（EC）的粘附和穿越激活的PMN与血管内皮细胞（VEC）相互作用形成的粘附连锁反应是PMN聚集、活化的关键，是导致组织损伤的先决条件[6,7]。

在急性炎症损伤过程中，PMN粘附、穿越VEC向炎症部位游走的分子基础是PMN与VEC表面粘附分子的相互作用[8]。

粘附分为再灌注早期PMN与沿着VEC表面慢速滚动的不稳定粘附以及随后的牢固粘附两个阶段。

现已知的粘附分子主要有选择素家族、整合素家族和免疫球蛋白超家族。

2.1 选择素家族(Selectin)选择素家族成员是介导白细胞和EC早期粘附过程的关键粘附分子。

此族分子为高度糖基化的单链跨膜糖蛋白，分子量为90～140ku。

主要包括L选择素，E选择素和P选择素。

L-selectin表达于白细胞(中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞)表面，当白细胞活化后通过蛋白水解方式释放出来,其功能为介导PMN与VEC的粘附以及淋巴细胞向周围淋巴结的归巢。

E-selectin表达于受刺激的EC表面，EC中无预存的E-selectin，当受刺激4～6小时后通过转录产生[9]。

并介导PMN、单核细胞与激活的内皮细胞相粘附，其配基存在于PMN及巨噬细胞上[10]。

P选择素表达于内皮细胞表面和活化的血小板，介导EC和PMN 的粘附以及激活的血小板与单核细胞和PMN的粘附[11]。

在粘附早期，L选择素对PMN 的旋转和初始粘附中起着非常重要的作用，同时也有P、E选择素的参与[12,13]，它们相互调节，先后发挥作用。

2.2整合素家族(Integrin)整合素(integrin)是一群由α、β多肽链组成的异二聚体分子，根据β链的不同划分为β1、β2、β3三组。

与PMN粘附相关的β2整合素依据α-链(CD11 )的不同分为三种类型，即CD11a/CD18、CD11b/ CD18、CD11c/CD18，广泛存在于各种类型的白细胞上。

CD11a/CD18配体是细胞间粘附分子-1 (ICAM-1 )，ICAM-2和ICAM-3，CD11b/ CD18配体是补体C3b 灭活因子(C3bi)，X因子和ICAM-1，CD11c/CD18的配体是ICAM-1和ICAM-3。

CD11/CD18同其配体ICAM相互协同介导粒细胞－内皮细胞粘附及粒细胞跨壁迁移。

康舟军[14]等研究缺血-再灌注过程中白细胞与内皮细胞粘附机制时发现，PMN与内皮细胞粘附增强主要由CD18数量表达增加所致。

Tajra LC[15]等应用抗CD11a、CD11b、CD18单克隆抗体可明星减轻缺血-再灌注损伤，PMN在组织中的浸润积聚减少。

2.3 免疫球蛋白超家族主要包括细胞间粘附分子(ICAM-1、ICAM-2)、血管细胞粘附分子(VCAM-1 )、血小板内皮细胞粘附分子(PECAM-1 )等。

存在于内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和少量造血细胞。

ICAM-1作为β2-整合素的配体在PMN与EC后期粘附以及PMN跨内皮移行中起重要作用；ICAM-1活化后通过信号转换诱导内皮细胞骨架相关蛋白酪氨酸磷酸化，改变细胞骨架结构，介导活化白细胞穿过内皮细胞及基膜向组织浸润积聚[16]；肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素-1 (IL-1 )、干扰素-γ(INF-γ)以及内毒素可增加ICAM-1的表达。

ICAM - 2对以上因素的刺激则相对稳定。

VCAM-1在IL-1、TNF-α等细胞因子活化的血管内皮细胞上表达，其配体是分布在白细胞表面的VLA-4分子。

Muller W A[17]等研究发现PECAM-1在白细胞穿越内皮层的过程中起着重要的作用。

用PECAM-1单抗或重组可溶性PECAM-1分子处理，可阻断白细胞穿过内皮层，但不影响白细胞与内皮细胞的紧密粘附，而且可见单抗处理后的白细胞大量粘附在内皮细胞连接部位。

在PMN与内皮细胞粘附过程中每种粘附分子所起的作用各不相同（图1）。

Kubes等[18]观察P-选择素，CD18，ICAM-1单抗对猫肠系膜静脉缺血1h再灌注后白细胞与内皮细胞的粘附关系。

再灌注10 min时P-选择素单抗明显抑制白细胞的粘附，CD18及ICAM-1单抗无影响，而再灌注1h CD18及ICAM-1单抗发挥了明显的抑制作用，提示在再灌注早期主要是P-选择素起作用，而在再灌注晚期主要是CD18和ICAM-1在起作用。

Bauer等[19]研究发现，小鼠肠系膜上动脉夹闭缺血45min，再灌注5h后小肠组织E-selectin表达与对照组相比增加5倍。

吕艺[20、21]等亦发现GIR损伤可导致PMN上CD11b/ CD18及血管内皮细胞上ICAM-1表达上调，由此介导的中性粒细胞在局部聚集、活化可能是造成肠粘膜上皮细胞损伤和肠通透性增加的病理生理学基础。

而且PMN穿越内皮细胞也同粘附分子作用有密切联系，CD11/CD18、ICAM-1表达升高和L-选择素表达下降，有利于PMN 穿越内皮细胞侵入组织[22]。

在IRI早期，选择素家族调节PMN沿EC的旋转和初始粘附，其后才能在整合素家族和免疫球蛋白超家族的作用下，PMN和EC牢固粘附、变形，然后移出血管到组织中[23,24]。

图1 中性粒细胞粘附、穿越血管内皮细胞过程的模式图三PMN介导组织损伤的炎性介质和细胞因子3.1炎性介质在组织损伤中的作用3.1.1 氧自由基正常情况下，PMN内的NADPH氧化酶处于静息状态，当受外界因素(如PMA等)刺激时可在15～60s内被激活，启动呼吸爆发过程，3min可达到峰值。

GIR损伤可激活存在于PMN膜上的NADPH氧化酶，诱导PMN呼吸爆发，通过催化O2的消耗产生大量活性氧代谢产物，如超氧阴离子(O2－)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2 )、次氯酸(HOCl)等。

缺血和再灌注均可抑制细胞内抗氧自由基的重要防御体系谷胱甘肽氧化还原系统，使谷胱甘肽过氧化物酶活性下降、还原型谷胱甘肽合成减少，细胞清除氧自由基能力降低，导致大量毒性氧自由基在组织细胞内堆积。

小肠对氧自由基的损伤极为敏感，GIR后氧自由基通过脂质过氧化反应破坏肠粘膜屏障，并促进PMN积聚于受损组织的炎性反应，导致严重的肠粘膜损伤[25]。

氧自由基主要通过以下几种途径造成对组织、器官的损伤：(1) 氧自由基结合生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，组织细胞能量代谢障碍，ATP合成减少，导致组织细胞损伤；(2) 通过对蛋白质、核酸、糖类的损害，使蛋白质多肽键断裂、DNAH和RNA主链断裂或碱基丢失、影响细胞糖代谢致细胞免疫功能降低；(3) 破坏间质胶原肽键、解聚透明质酸等损伤细胞间质；(4) 氧自由基可与酶分子进行氢抽取和进一步的加成作用而生成酶分子的聚合物，造成细胞内酶分子的结构和功能障碍。

例如三羧酸循环中的穿梭酶系和脱氢酶系受抑制，可引起细胞内呼吸停止；(5) 消耗大量内源性超氧化物歧化酶(SOD)，血浆溶酶体酶活性增加，导致机体抗氧化能力下降；(6) 通过降解基底膜成分和损伤VEC，以及激活花生四烯酸产生前列腺素和白三烯而使血管通透性增加，使炎性介质及血浆蛋白渗入组织间隙，引起组织水肿，进一步发展为MODS。

3.1.2 血小板活化因子(PAF)PAF是一种以前体形式贮存于细胞膜内的磷脂，也是一种强效的炎性介质和趋化因子。

通过激活磷脂酶A2和PAF乙酰转移酶，PMN产生并释放PAF。

PAF主要作用是活化血小板，促使血小板粘附、聚集；上调粘附分子β2整合素，改变内皮细胞内骨架蛋白，引起毛细血管通透性增加；诱导PMN“呼吸爆发”和脱颗粒，刺激其他活性物质、细胞因子及炎性介质的产生，参与缺血-再灌注损伤。

PAF还能诱导PMN表面CD11b/CD18表达增加，下调E-选择素表达水平，有利于PMN进入组织中[22]。

3.1.3 白三烯(leukotrienes)白三烯是花生四烯酸(AA)的脂氧酶代谢产物，具有许多生物学活性。

主要包括：(1)白三烯C4(LTC4)，能增加血管壁通透性。

(2)白三烯B4(LTB4)。

LTB4主要通过脂质过氧化酶途径合成，对PMN有强烈的趋化作用，激发PMN产生“呼吸爆发”和脱颗粒，能引起白细胞的粘附、聚集与溶酶体酶的释放，刺激磷酸脂酶活性，在VEC损伤及血管壁通透性增加中起间接作用。

Zimmerman BJ[26]等研究发现使用LTB4抗体SC-41930可明显减弱GIR诱导的PMN在组织中的渗出，提示LTB4主要功能是促进PMN在组织中的聚集。

3.1.4 弹性蛋白酶GIR损伤可激活PMN通过脱颗粒作用产生大量的颗粒酶，其中弹性蛋白酶是最具破坏力的酶，是导致炎症性组织损伤的重要物质，它可通过降解弹性蛋白，分解细胞外基质；分解连接组织的其它成分,如胶原蛋白、纤维连接蛋白等；降解免疫球蛋白、凝血因子等血浆蛋白；裂解补体。

它还能诱导细胞因子的表达，如白介素-8(IL-8)、粒细胞刺激因子、血小板生长因子B、转移生长因子β和内皮素等[27]，而这些物质又能吸引和激活中性粒细胞释放更多的弹性蛋白酶，形成恶性循环，加重组织损伤。