DNA重组及重组DNA技术PPT课件
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• 多聚核苷酸激酶 • 碱性磷酸酶
合成双链cDNA分 子
5ˊ羟基末端 磷酸化
切除末端 磷酸基
1. 限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease, RE）
能识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
由于能限制外源DNA的 “入侵”而得名。与甲 基化酶共同构成细菌的 限制修饰系统，限制外 源DNA， 保护自身DNA
ori
多克隆位点 四环素抗 性基因
目录
•λ噬菌体 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA
组成 。λ噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链DNA， 它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿 主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装 成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。
从3' 端切割产生3' 端突出的粘性末端。如Pst Ⅰ：
5' …C TGCA▼G…3' Pst I 5' …CTGCA 3'
G…3'
3' …G▲ACGT C…5'
3' …G
3' ACGTC… 5'
限制性内切酶作用过程
点击播放
1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一 链序列)中不属于完全回文结构的是 A．AGAATTCT B. TGAATTCA C．GGAATTCC D．CGTTAAGC E．AGATATCT
质粒（plasmid）
质粒是存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA分子，能在宿主 细胞独立自主地进行复制，并在细 胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。 质粒带有某些遗传信息，会赋予宿 主细胞新的遗传性状。
因为质粒DNA有自我复制功能及携 带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。
氨苄青霉素 抗性基因
主要来源于 原核生物
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…AGCTG▼AATTC…3’产生 5' 端突出的粘性末端
2．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…CTGCA▼GAGTC…3’产生 3' 端突出的粘性末端
3．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…AGGTT▼AACAG…3’产生 平末端
（二）载体的分类
3' …CAA▲TTG…5'
3' …CAA TTG… 5'
在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5' 端切割产生5' 端突出的粘性末端，如EcoR Ⅰ ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTA A 5'
5' AATTC…3' G… 5'
常用的载体按来源分为： 质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus)
按得到的产物，载体可分为： 克隆载体（cloning vector）主要用于基因片断的扩增 表达载体（expression vector）用于获得目的基因编 码的蛋白质
载体的选择标准
• 复制起始点，能自主复制； • 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的 筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多 个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
舟行水面水行舟
•A segment of double-stranded DNA in which the nucleotide sequence of one strand reads in reverse order to that of the complementary strand. •In the same strand containing complementary nucleotide sequence with opposite polarity.
酶切鉴定
基因克隆的基本步骤
• 分：分离目的基因和载体DNA。 • 切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生
匹配的末端。 • 接：连接酶将目的基因装入载体。 • 转：转入宿主细胞。 • 筛：筛选具有重组DNA分子的阳性克隆。
一、工具酶
• 限制性核酸内切酶 • 连接酶 • 聚合酶(Taq酶、末
端转移酶)
DNA重组和重组DNA技术
萤火虫的发光基因对烟草说： “要有光”，烟草就发光了。
起初上帝创造天地， 地是空虚混沌，渊面黑暗，
上帝的灵运行在水面上， 上帝说：“要有光，就有了光。”
------《旧约全书·创世纪》
第二节 重组DNA技术
DNA Recombination Technique
本节主要内容
切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’ 端为磷酸基，3’ 端为羟基。
II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口
在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如Hpa I：
5' …GTT▼AAC…3' Hpa I 5' …GTT AAC…3'
基因克隆的主要操作步骤
分(分离) 目的基因
粘性末端
切(切割)
质粒
粘性末端
匹配的粘性末端
酶切后的目的基因片段 接(连接)
连接后的重组 质粒DNA分子
转(转化)
目的基因
染色体
重组质粒
真好玩!
大肠杆菌
大肠杆菌 筛(筛选) 大肠杆菌
含抗生素的培养基 玩完啦!
分解抗生 素的酶
还活着!
源自文库
大量生长
提取大量质粒
DNA克隆
重组DNA技术相关概念
工具酶 目的基因 基因载体
重组DNA技术基本原理及操作步骤
PCR、核酸杂交
重组DNA技术
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力 的重组DNA分子——复制子(replicon)，继而通 过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的 转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA 分子，也称分子克隆或重组DNA 技术 。
合成双链cDNA分 子
5ˊ羟基末端 磷酸化
切除末端 磷酸基
1. 限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease, RE）
能识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
由于能限制外源DNA的 “入侵”而得名。与甲 基化酶共同构成细菌的 限制修饰系统，限制外 源DNA， 保护自身DNA
ori
多克隆位点 四环素抗 性基因
目录
•λ噬菌体 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA
组成 。λ噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链DNA， 它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿 主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装 成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。
从3' 端切割产生3' 端突出的粘性末端。如Pst Ⅰ：
5' …C TGCA▼G…3' Pst I 5' …CTGCA 3'
G…3'
3' …G▲ACGT C…5'
3' …G
3' ACGTC… 5'
限制性内切酶作用过程
点击播放
1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一 链序列)中不属于完全回文结构的是 A．AGAATTCT B. TGAATTCA C．GGAATTCC D．CGTTAAGC E．AGATATCT
质粒（plasmid）
质粒是存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA分子，能在宿主 细胞独立自主地进行复制，并在细 胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。 质粒带有某些遗传信息，会赋予宿 主细胞新的遗传性状。
因为质粒DNA有自我复制功能及携 带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。
氨苄青霉素 抗性基因
主要来源于 原核生物
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
1．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…AGCTG▼AATTC…3’产生 5' 端突出的粘性末端
2．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…CTGCA▼GAGTC…3’产生 3' 端突出的粘性末端
3．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…AGGTT▼AACAG…3’产生 平末端
（二）载体的分类
3' …CAA▲TTG…5'
3' …CAA TTG… 5'
在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5' 端切割产生5' 端突出的粘性末端，如EcoR Ⅰ ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTA A 5'
5' AATTC…3' G… 5'
常用的载体按来源分为： 质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus)
按得到的产物，载体可分为： 克隆载体（cloning vector）主要用于基因片断的扩增 表达载体（expression vector）用于获得目的基因编 码的蛋白质
载体的选择标准
• 复制起始点，能自主复制； • 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的 筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多 个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
舟行水面水行舟
•A segment of double-stranded DNA in which the nucleotide sequence of one strand reads in reverse order to that of the complementary strand. •In the same strand containing complementary nucleotide sequence with opposite polarity.
酶切鉴定
基因克隆的基本步骤
• 分：分离目的基因和载体DNA。 • 切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生
匹配的末端。 • 接：连接酶将目的基因装入载体。 • 转：转入宿主细胞。 • 筛：筛选具有重组DNA分子的阳性克隆。
一、工具酶
• 限制性核酸内切酶 • 连接酶 • 聚合酶(Taq酶、末
端转移酶)
DNA重组和重组DNA技术
萤火虫的发光基因对烟草说： “要有光”，烟草就发光了。
起初上帝创造天地， 地是空虚混沌，渊面黑暗，
上帝的灵运行在水面上， 上帝说：“要有光，就有了光。”
------《旧约全书·创世纪》
第二节 重组DNA技术
DNA Recombination Technique
本节主要内容
切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’ 端为磷酸基，3’ 端为羟基。
II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口
在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如Hpa I：
5' …GTT▼AAC…3' Hpa I 5' …GTT AAC…3'
基因克隆的主要操作步骤
分(分离) 目的基因
粘性末端
切(切割)
质粒
粘性末端
匹配的粘性末端
酶切后的目的基因片段 接(连接)
连接后的重组 质粒DNA分子
转(转化)
目的基因
染色体
重组质粒
真好玩!
大肠杆菌
大肠杆菌 筛(筛选) 大肠杆菌
含抗生素的培养基 玩完啦!
分解抗生 素的酶
还活着!
源自文库
大量生长
提取大量质粒
DNA克隆
重组DNA技术相关概念
工具酶 目的基因 基因载体
重组DNA技术基本原理及操作步骤
PCR、核酸杂交
重组DNA技术
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力 的重组DNA分子——复制子(replicon)，继而通 过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的 转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA 分子，也称分子克隆或重组DNA 技术 。