DNA重组及重组DNA技术PPT课件
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重组DNA技术基础.pptx
DNA：约200bp 组蛋白：H1 , H2A, H2B, H3, H4
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第30页/共65页
RNA的结构
Structure of RNA
第31页/共65页
RNA的种类、分布、功能
细胞核和胞液 线粒体 功
能
核蛋白体RNA 信使RNA
rRNA mRNA
mt rRNA 核蛋白体组分 mt mRNA 蛋白质合成模板
在1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。 RNA+蛋白质→核糖核蛋白（RNP）： 在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。
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2. 酸碱性
核酸属于两性电解质，但因为磷酸 的酸性较强，因此总体呈现较强的酸 性。具有较低的等电点。当溶液的 pH4时，呈多负离子状态，容易与 金属离子结合形成盐。
• RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解RNA。
➢依据切割部位不同 • 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非 特异性限制性核酸内切酶。 • 核酸外切酶：5´→3´或3´→5´核酸外切酶。
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转运RNA
tRNA
mt tRNA 转运氨基酸
核内不均一RNA HnRNA
成熟mRNA的前体
核内小RNA
SnRNA
参与hnRNA的剪接、转运
核仁小RNA
SnoRNA
rRNA的加工、修饰
胞浆小RNA scRNA/7SL-RNA
蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分
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mRNA rRNA tRNA
核酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 确定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
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RNA的结构
Structure of RNA
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RNA的种类、分布、功能
细胞核和胞液 线粒体 功
能
核蛋白体RNA 信使RNA
rRNA mRNA
mt rRNA 核蛋白体组分 mt mRNA 蛋白质合成模板
在1 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。 RNA+蛋白质→核糖核蛋白（RNP）： 在0.14 mol/L的NaCl溶液中的溶解度最大。
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2. 酸碱性
核酸属于两性电解质，但因为磷酸 的酸性较强，因此总体呈现较强的酸 性。具有较低的等电点。当溶液的 pH4时，呈多负离子状态，容易与 金属离子结合形成盐。
• RNA酶 (ribonuclease, RNase)： 专一降解RNA。
➢依据切割部位不同 • 核酸内切酶：分为限制性核酸内切酶和非 特异性限制性核酸内切酶。 • 核酸外切酶：5´→3´或3´→5´核酸外切酶。
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转运RNA
tRNA
mt tRNA 转运氨基酸
核内不均一RNA HnRNA
成熟mRNA的前体
核内小RNA
SnRNA
参与hnRNA的剪接、转运
核仁小RNA
SnoRNA
rRNA的加工、修饰
胞浆小RNA scRNA/7SL-RNA
蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分
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mRNA rRNA tRNA
核酸分子杂交的应用
研究DNA分子中某一种基因的位置 确定两种核酸分子间的序列相似性 检测某些专一序列在待检样品中存在与否 是基因芯片技术的基础
重组DNA技术ppt课件
限制性核酸内切酶
切割DNA分子实 质是断开两个核 苷酸之间的磷酸 二酯键。
磷酸二酯键
DNA分子
限制酶的识别序列：
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修
饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
目录
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
作为基因工程运载体的条件
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④载体是安全的，不能对受体细胞有害。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN带的所 有基因组DNA核苷酸序列不久即将完成。 但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。
人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。
DNA重组技术ppt课件
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
２．于４２℃水浴９０秒。
３．冰浴２分钟。
４．加入８００μl LB液体培养基 ３７℃４５分钟。
５．取２００μl涂布于含Amp(５０μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
注意事项
-80℃冰箱储存的感受态细胞在5-6周后，转 化率很低。可用一已知标准闭环质粒鉴定 感受态细胞的转化能力。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
并确定并确定??此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的11dna分子的体外连接dna分子的体外连接??dna分子的体外连接就是在一定条件下dna分子的体外连接就是在一定条件下由dna连接酶催化两个双链dna片段由dna连接酶催化两个双链dna片段组邻的5组邻的5端磷酸与3端磷酸与3端羟基之间形成组邻的组邻的端磷酸与端磷酸与磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子磷酸酸脂键的生物化学过程dna分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的
高连接效率。
DNA重组技术的基本步骤PPT课件
-
41
（1）、农杆菌转化法
-
42
转移至受体细胞 整合到染色体上
-
43
P15-2
根据农杆菌可将目的基因导入双子 叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能 将目的基因导入单子叶植物的原因吗？ 若想将一个抗病基因导入单子叶植物 (如小麦），从理论上说，你认为应该 怎么做？
因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌， 向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉
1、什么是目的基因？
2、获取目的基因的方法有哪些？其操 作过程分别是怎样的？
-
9
1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也 可以是一些具有调控作用的因子。
2、目的基因获取方法： Ⅰ、从基因中获取目的基因 Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因 Ⅲ、化学方法直接人工合成 8100 C. 17280 D. 7560
-
28
4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分 子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR
技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 D
①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四 种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定 DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温
-
36
目的基因与运载体结合所需的条件有 D
①同一种限制酶 ②具有抗性基因的质粒
③RNA聚合酶 ④目的基因
⑤DNA连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸
⑦ATP
A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦
C．①②③④⑤
D．①②④⑤⑦
（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
重组DNA技术PPT课件
3. cDNA 4. 聚合酶链反应
2021/3/7
CHENLI
4
基本概念
• 基因（gene）：P219
• 基因组（genome）：P292
• 基因组学（genomics）：
研究基因组的结构、信息与功能的 科学。
• 基因组计划：HGP——P440
• 后基因组
• 功能基因组
2021/3/7
CHENLI
CHENLI
16
(五)重组体的筛选
直接选择法
1. 抗药性选择 2. 标志补救 3. 分子杂交法
2021/3/7
间接筛选法
核酸水平
蛋白质水平
*1. 酶切图谱 *2. 核酸探针 *3. PCR *4. 序列测定
CHENLI
免疫学的技术： SDS-PAGE 、 Western blot 、 ELISA 、 放 免 、 免疫沉淀、 荧光抗体等
2. 平端DNA间的连接
3. 同聚物加尾连接
4. 人工接头连接
2021/3/7
CHENLI
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2021/3/7
CHENLI
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CHENLI
14
(四)重组DNA分子导入受体菌
• 无性繁殖
• 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态.
• 方式:
转化、转染、感染
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2021/3/7
CHENLI
第40章、重组DNA技术
1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选
6. 克隆基因的表达
2021/3/7
CHENLI
DNA重组(共26张PPT)
加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
Klenow
补平
DNA接头(adapter)连接法
连C5T'杆G的CA5G’-末GG端G和GC待G克隆的DNA片段5G’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化G，A然T后C再C通过T4DNA连接酶G的G作A用T使C两者连接起来。
G C 3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
：在最佳反应条件下15 才能发挥其连接DNA分子的功能作用
3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
℃反应1 小时，完全连接 目的序列回收产 5.0μL 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
能源辅助因子 NAD+
ATP
功能
催化DNA粘性末端 粘性末端、平末
的连接
端均可连接
5.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活性 10×连接缓冲液 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
5 体外连接DNA片段的方式
1.0μL
这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，
5'
5' GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAGBa5m位' H点I酶切
GAATTGGGGGGGATCC
GGATCCCCCCC AATTC
Klenow
补平
DNA接头(adapter)连接法
连C5T'杆G的CA5G’-末GG端G和GC待G克隆的DNA片段5G’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化G，A然T后C再C通过T4DNA连接酶G的G作A用T使C两者连接起来。
G C 3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
：在最佳反应条件下15 才能发挥其连接DNA分子的功能作用
3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
℃反应1 小时，完全连接 目的序列回收产 5.0μL 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
能源辅助因子 NAD+
ATP
功能
催化DNA粘性末端 粘性末端、平末
的连接
端均可连接
5.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活性 10×连接缓冲液 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
5 体外连接DNA片段的方式
1.0μL
这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，
5'
5' GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAGBa5m位' H点I酶切
GAATTGGGGGGGATCC
GGATCCCCCCC AATTC
重组DNA技术详细概述PPT(41张)
动物和植物 基到某种载体上能够 代表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的 DNA片段的集合。根据序列的来源，可分 为基因组和cDNA。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
《重组DNA技术》课件
发展更精准、高效的基因编辑 技术。
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
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切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’ 端为磷酸基，3’ 端为羟基。
II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口
在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如Hpa I：
5' …GTT▼AAC…3' Hpa I 5' …GTT AAC…3'
• 多聚核苷酸激酶 • 碱性磷酸酶
合成双链cDNA分 子
5ˊ羟基末端 磷酸化
切除末端 磷酸基
1. 限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease, RE）
能识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
由于能限制外源DNA的 “入侵”而得名。与甲 基化酶共同构成细菌的 限制修饰系统，限制外 源DNA， 保护自身DNA
3' …CAA▲TTG…5'
3' …CAA TTG… 5'
在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5' 端切割产生5' 端突出的粘性末端，如EcoR Ⅰ ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTA A 5'
5' AATTC…3' G… 5'
基因克隆的主要操作步骤
分(分离) 目的基因
粘性末端
切(切割)
质粒
粘性末端
匹配的粘性末端
酶切后的目的基因片段 接(连接)
连接后的重组 质粒DNA分子
转(转化)
目的基因
染色体
重组质粒
真好玩!
大肠杆菌
大肠杆菌 筛(筛选) 大肠杆菌
含抗生素的培养基 玩完啦!
分解抗生 素的酶
还活着!
大量生长
提取大量质粒
ori
多克隆位点 四环素抗 性基因
目录
•λ噬菌体 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA
组成 。λ噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链DNA， 它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿 主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装 成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。
从3' 端切割产生3' 端突出的粘性末端。t I 5' …CTGCA 3'
G…3'
3' …G▲ACGT C…5'
3' …G
3' ACGTC… 5'
限制性内切酶作用过程
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1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一 链序列)中不属于完全回文结构的是 A．AGAATTCT B. TGAATTCA C．GGAATTCC D．CGTTAAGC E．AGATATCT
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
舟行水面水行舟
•A segment of double-stranded DNA in which the nucleotide sequence of one strand reads in reverse order to that of the complementary strand. •In the same strand containing complementary nucleotide sequence with opposite polarity.
1．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…AGCTG▼AATTC…3’产生 5' 端突出的粘性末端
2．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…CTGCA▼GAGTC…3’产生 3' 端突出的粘性末端
3．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割 5’…AGGTT▼AACAG…3’产生 平末端
（二）载体的分类
DNA克隆
重组DNA技术相关概念
工具酶 目的基因 基因载体
重组DNA技术基本原理及操作步骤
PCR、核酸杂交
重组DNA技术
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力 的重组DNA分子——复制子(replicon)，继而通 过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的 转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA 分子，也称分子克隆或重组DNA 技术 。
常用的载体按来源分为： 质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus)
按得到的产物，载体可分为： 克隆载体（cloning vector）主要用于基因片断的扩增 表达载体（expression vector）用于获得目的基因编 码的蛋白质
载体的选择标准
• 复制起始点，能自主复制； • 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的 筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多 个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
质粒（plasmid）
质粒是存在于细菌染色体外的 小型环状双链DNA分子，能在宿主 细胞独立自主地进行复制，并在细 胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。 质粒带有某些遗传信息，会赋予宿 主细胞新的遗传性状。
因为质粒DNA有自我复制功能及携 带遗传信息等特性，可作为重组 DNA操作的载体。
氨苄青霉素 抗性基因
DNA重组和重组DNA技术
萤火虫的发光基因对烟草说： “要有光”，烟草就发光了。
起初上帝创造天地， 地是空虚混沌，渊面黑暗，
上帝的灵运行在水面上， 上帝说：“要有光，就有了光。”
------《旧约全书·创世纪》
第二节 重组DNA技术
DNA Recombination Technique
本节主要内容
酶切鉴定
基因克隆的基本步骤
• 分：分离目的基因和载体DNA。 • 切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生
匹配的末端。 • 接：连接酶将目的基因装入载体。 • 转：转入宿主细胞。 • 筛：筛选具有重组DNA分子的阳性克隆。
一、工具酶
• 限制性核酸内切酶 • 连接酶 • 聚合酶(Taq酶、末
端转移酶)
主要来源于 原核生物
命名
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属系 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）