质粒载体的构建分析

质粒载体的构建

摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。

关键词：质粒DNA PCR 电泳感受态转化

1.引言

质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：

①是染色质外的双链共价闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质

粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。

②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而

传给后代。

③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的

特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。

所以质粒对宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体

都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。

质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。

质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。

质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。

构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。

2. 材料方法

2.1目的DNA的获得

2.1.1 引物设计

第一次引物设计：

正向引物：sinn3F 冰盒标注：P2a

引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’

引物长度：25bp

反向引物：sinn3R 冰盒标注：P2b

引物序列：5’—GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’

引物长度：22bp

第二次引物设计（带酶切位点）：

正向引物：sinn3FE 冰盒标注：P2c

引物序列：

5’—ACTGGATCC AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’引物长度：34bp

反向引物：sinn3RE 冰盒标注：P2d

引物序列：

5’—TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’引物长度：34bp

2.1.2 PCR扩增

2.1.2.1 PCR技术的基本原理

PCR即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、延伸、复性等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 的过程.是一项DNA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面.

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2 PCR反应的基本步骤:

1.变性: 高温使双链DNA解离成单链.（94℃ 30s）

2.退火:低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子.（55℃ 30s）

3.延伸:中温延伸. 在DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下, DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5’向3’方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链.（70-72℃30-60s）

以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,

目的DNA以2n形式增加.

2.1.2.2 PCR检测

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法

2.1.2.3 PCR反应体系

第一次PCR扩增:

调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件,经多次反复试验结果得出下面的体系可得到清晰明亮的目的DNA电泳条带（1kb）: PCR反应体系2*100ul（每管25ul,共8管）

Pyrobest 2ul

buffer（10x） 10ul

WT4（模板） 2ul

P2a（10uM） 4ul

P2b（10uM） 4ul

dNTP（2.5x） 2ul

ddH2O 76ul

PCR反应条件:

94℃ 5min

30 cycles: 94℃ 40s

53℃ 40s

72℃ 2min30s

72℃ 10min