当归多糖ASP3的甲基化分析

41 2 58 8
T o ta l
100 0
T
2, 3, 5 M e3 A raf
1, 5 2, 3 M e2 A raf
62 4 19 3
1, 3, 5 2 M e A raf
18 3
T o ta l
100 0
T 1, 6 1, 3, 6 1, 4 1, 4, 6
2, 3, 4, 6 M e4 G alp 2, 3, 4 M e3 G alp 2, 4 M e2 G alp 2, 3, 6 M e2 G alp 2, 6 M e2 G alp
13 68
高等学校化学学报
V o .l 29
ASP3 PH. 用 N2 气除去多余的 TFA 后, 加水复溶, 冷冻干燥, 得到 ASP3部分酸水解产物. 1. 2. 2 羧基还原 称取约 5 m g ASP3样品, 用 D2O 溶解后, 加入 CMC 充分溶解, 调 pH = 4 75; 加入 N aBD4 溶液进行羧基还原; 调 pH 至酸性, 对水透析 (截留 M w = 3500) , 冷冻干燥后, 溶于 0 5 mL 水 中, 除去硼酸根, 在 N2 气氛下挥发至干 [ 6] . 1. 2. 3 甲基化反应 称取约 3 m g经羧基还原的多糖样品于具塞反应瓶中, 加入无水 DM SO 充分溶解 后, 分别加入 N aOH 干燥粉末和碘甲烷进行甲基化反应; 反应液用二氯甲烷萃取, 过 N a2 SO4 柱, 收集 滤液, 在 N 2 气氛下挥发至干 [ 7] . 1. 2. 4 甲基化产物的水解、还原和乙酰化 将甲基化产物用 TFA 溶液水解, 再用 N aBD4 进行还原; 将还原产物除去硼酸根, 在 N2 气氛下挥发至干; 加入 0 5 mL 乙酸酐于 100 ∀ 衍生为部分甲基化的糖 醇乙酸酯衍生物 ( PMAA ) . 用二氯甲烷萃取, 过 N a2 SO 4 柱, 收集滤液, 进行 GC M S分析 [ 8~ 10] . G C M S 分析条件: OV1701 毛细管柱 ( 0 25 mm # 30 m, 膜厚 0 25 mm ), 程序升温: 起始温度 150 ∀ , 以 3 ∀ /m in的速度升温至 250 ∀ , 停留 10 m in, 载气为氦气. E I+ 源, 电子能量 70 eV, 接口温度 250 ∀ , 离子源温度 200 ∀ , 检测器电压 350 V.
ASP3经 0 2 m ol /L TFA 水解、透析后, 截留液组分 ASP3 PH 的 G alA ( 76 48% ) 和 Rha( 2 7% ) 的
含量较水解前均有所增加, 而 A ra, Ga,l M an和 G lc的含量明显下降, 表明 GalA 和 Rha位于主链上,
不易被弱酸水解; A ra, G a,l G lc及 M an位于 ASP 3多糖分子的支链, 水解速度较快. ASP3 PH 还含有
70 93 0 100 0
M olar fraction( % ) b
1 76
13 58
27 88 0 73
56 06
tR /m in 12 79 16 90
8 44 13 28 16 72
14 86 21 01 25 24 19 09 24 39
18 40
13 93 18 67
a. R elat ivem olar ratio, calcu lated from the ratio of peak areas; b. paren t
由 T , 1, 5 , 1, 3, 5 A raf 和 T , 1, 3 , 1, 3, 6 , 1, 4 , 1, 4, 6D G a lp 聚合形成的阿拉伯半乳聚糖、半乳聚糖以及
阿拉伯聚糖是 ASP 3侧链 的主要组成, 通过 R hap 残基的 O 4位与主链相连.
关键词 当归; 多糖; 甲基化分析 ; 部分酸水解
述判断.
2. 2 ASP3的甲基化分析
ASP3经羧基还原及甲基化反应后的 PMAA (部分甲基化的糖醇乙酸酯 ) 进行 GC M S分析, GC /M S
重构总离子流图谱如图 1所示. 根据质谱图的质子
碎片峰和 ASP3的单糖组成, 结合标准图谱对各峰
进行归属, ASP3的甲基化分析结果见表 2.
甲基化分析结果表明: ( 1) ASP3 主要由 1, 4
D Ga lpA; T , 1, 6 , 1, 3, 6, 1, 4, 1, 4, 6 D Galp;
T , 1, 5, 1, 3, 5 A raf 以及 1, 2 , 1, 2, 4 L Rhap 组
成. ( 2) Rha残基主要以 1∃ 2连接方式存在, 其中
58 8% 的 Rhap 在 O 4 位被取代成为 1, 2, 4 Rhap.
一定量的 Ga l( 19 2% ) , A ra含量极低 ( 0 2% ), 表明 Ga l以较高的聚合度与主链相连, 导致其水解速
度较慢; 而 Ara则以还原性末端或低聚寡糖的形式与主链相连或与半乳聚糖末端相连, 因此水解比较
彻底. 透过液 ASP3 PL 中的 Ga l和 A ra含量较高, 表明绝大部分的 Ara, Ga l和 G lc已被水解, 证明了上
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器 当归, 购自无锡山禾药业有限公司, 经鉴定为二级岷归; 当归经热水提取, 乙醇沉淀, 透析, 经
DEAE Sepharose CL 6B柱层析梯度洗脱, 透析, 冻干, 制得当归多糖 ASP3; 经 Sepharose CL 6B柱层析 为单一 对称 峰, 表 明 为分 子 量 相 对 均一 组 分 [ 1] ; CMC [ 1 Cyc lohexy l 3 ( 2 m orpho linoethyl) carbod i im idem ethy l p toluenesu lfonate] , F luka公司; N aBD4, Acpos公司; 无水二甲亚砜, A ldrich公司; 间羟基 联苯, S igm a公司; 碘甲烷, 浙江海川化学品有限公司; D2O ( 99 9% ) 、二氯甲烷和三氟乙酸等试剂均 为分析纯. F innigan T raceM S GC M S分析仪, 美国 F inn igan公司; GC 14A 型气相色谱仪, 日本 Shim ad zu 公 司. 1. 2 实验过程 1. 2. 1 部分酸水 解 称取约 20 m g ASP3 于具塞瓶 中, 分别溶于 4 mL 0 2 m o l/L TFA 溶液中, 于 100 ∀ 水解 1 h. 水解液对水透析 ( 截留 Mw = 3500), 得到低分子量透过液 ASP3 PL 和高分子量截留液
摘要 通过部分酸水解 和甲基化分析, 结合 GC M S测试手段, 对当归多糖 A SP3的糖链结构进行了研究. 采
用 0 2 m ol/L 三氟乙酸 ( T rifluoro ace tic ac id, TFA )对 ASP3进行了部分酸水解, 对水解前后的多糖组分进行甲
基化分析. 结果显示: A SP3的 糖残基主 要由 D G alpA, D G a lp, L A raf 和 L Rhap 组成, 主链 由 1, 4 D G a lpA
2 结果与讨论
2. 1 ASP3及其部分酸水解产物的组成分析 ASP3及其部分酸水解产物的单糖组成见表 1. 结果表明, 各级分的单糖组成种类较多, 是由不同
单糖残基构成的杂多糖. ASP3主要含 GalA, Ga,l A ra和 Rha以及少量的 M an和 G lc. 由单糖组成可知 A SP3 是一 种酸 性果 胶多 糖.
T ab le 1 Sugar com position of fractions from ASP3 by partial ac id hydrolysis
Fragm en t
A SP3 A SP3 PH A SP3 PL
M ass fract ion of G alA (% ) *
58 27 76 48
( 3) T , 1, 5 , 1, 3, 5 A raf 的摩尔比为 62 4%19 3% F ig. 1 Recon struc ted total ion chromatograph of
18 3 37 6% 的 Araf 残基以 1∃ 5连接成为阿拉伯
carboxyl reduced and m ethylated ASP3
中图分类号 O 629
文献标识码 A
Fra Baidu bibliotek
文章编号 0251 0790( 2008) 07 1367 04
当归为伞形科植物当归 [ Angelica sinensis( O liv. ) D iels] 的干燥根, 具有补血、活血、调经止痛、润 肠通便等功效. 近年来的研究发现, 当归多糖是其主要的活性成分, 具有调节免疫力、抗肿瘤、抗辐射 等功效 [ 1~ 4] .
连接, 形成 光滑区 半 乳糖醛酸聚糖, 由 1, 4 D G alpA 通过 O 4位与 1, 2 ; 1, 2, 4 L Rhap 的 O 2 位交替连接
形成含有较多分支的 毛发区 鼠李半乳 糖醛酸 聚糖. 58 8% 的 R hap 残基 发生 O 4位 取代 ( 1, 2, 4 L R hap ).
6 26
Rh a 19 27 T race
M olar fract ion of th e sugar residu es( % )
Ara
M an
G lc
10 5
04
09
02
T r ace
04
31 9
19
34
Gal 24 9 19 2 62 8
* Conten t of G alA is calcu lated.
14 9 30 7 34 9 12 3
72
T o ta l
100 0
1, 4 2, 3, 6 M e2 G lcp T o ta l
100 0 100 0
T 1, 4 T o ta l
2, 3, 4, 6 M e3 G alp( 6, 6! d2 ) 2, 3, 6 M e3 G alp ( 6, 6! d2 )
收稿日期: 2007 11 12. 基金项目: 山西省青年科研基金 ( 批准号: 2007021042) 、院级重点科研基金 ( 批准号: 20060102 )和院级学术带头人基金资助. 联系人简介: 孙元琳, 女, 博士, 副教授, 主要从事生物大分子的结构与功能研究. E m ai:l sylw ts@ yahoo. com. cn
N o. 7
孙元琳等: 当归多糖 A SP3的甲基化分析
1 36 9
T ab le 2 M e thylation analysis of ASP3
聚糖的主链 ( 19 3% 的 A raf 残基为 1∃ 5 连
L inkage PM AA
M olar fract ion( % ) a
1, 2 3, 4 M e2 R hap 1, 2, 4 3 M e R hap
果胶多糖是当归多糖的主要组成部分 [ 1] , 其化学组成和糖链结构都比较复杂. 甲基化分析是测定 多糖分子糖苷键连接方式的有效方法 [ 5] . 对于含有糖醛酸的多糖, 如植物果胶或其它酸性多糖, 其甲 基化分析难度较大. 这是因为: ( 1) 甲基化反应在碱性条件下进行, 糖醛酸在此过程中易发生 消去 反应, 使与之相连的中性糖产生降解; ( 2) 糖醛酸在酸性条件下不易水解, 因此直接甲基化会使糖醛 酸以及与其相连的中性糖的信息丢失, 影响甲基化分析结果的准确性. 由此, 本实验采用氘代试剂 N aBD4 将多糖样品中的 G a lA 还原为相应的中性糖, 同时用氘进行标记 ( 6, 6!d2 G a l) 以区别于样品中 的相应中性糖 ( Gal) , 再进行甲基化分析, 克服了上述缺陷.
Vo.l 29
2008年 7 月
高等学校化学学报
CHEM ICAL JOURNA L OF CH INESE UN IVER SIT IE S
No. 7
1367 ~ 1370
当归多糖 ASP3的甲基化分析
孙元琳 1, 3, 申瑞玲2, 汤 坚 3, 顾小红 3
( 1. 运城学院生命科学系, 运城 044000; 2. 郑州轻工业学院食品与生 物工程学院, 郑州 450002; 3. 江 南大学食品科学与技术国家重点实验室, 无锡 214122)